临床色谱质谱检验技术第三章 生物样品制备四.ppt

第三章 生物样品制备 临床基因组教研室 李维 邮箱：lab-liwei@ 2017.03.24 《临床色谱质谱检验技术》 一、常用样品制备技术 二、自动化样品制备 主要内容 《临床色谱质谱检验技术》 三、小结与思考 一、常用样品制备技术 液液萃取 稀释 固相萃取 离心 过滤 样品制备技术 蛋白沉淀 临床色谱质谱实验室常用样品制备技术 衍生化 定义 是一种基于液相色谱分离的样品制备方法，依据样品基质各种组分在固定相和流动相间分配系数的不同，使目标分析物得以保留和净化，同时选择性地去除样品基质中的干扰成分。 目的 分离、除去干扰、净化基质和富集目标分析物 （三）固相萃取（solid-phase extraction,SPE） 名称：C18-n（未封端） 基质：硅胶？聚合物基质？ 孔径：60Å 粒径：40-75μm 含碳量：12% 表面积：300㎡/g 键合相：碳十八烷基 作用机理：反相萃取 SPE结构 SPE产品形式 针筒形式 过滤嘴形式 96孔板形式 在线 SPE柱 （三）固相萃取 （三）固相萃取 基本操作步骤（以反相萃取为例） SPE配套装置 （三）固相萃取 固相萃取装置（常规） 96孔板正压装置 96孔板负压装置 （三）固相萃取 （三）固相萃取 分离模式 工作原理 相互作用力 键合相 反相固相萃取 吸附剂极性小于洗脱液极性 萃取中等极性到非极性化合物 非极性作用力 硅胶键合C18,C8, -苯基等 正相固相萃取 吸附剂极性大于洗脱液极性 萃取极性化合物 极性作用力 极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN，-Diol；极性吸附剂，如硅胶、氧化铝、硅藻土等 离子交换固相萃取 吸附剂是 带有电荷的离子交换树脂 萃取带有电荷的化合物 静电引力 强酸性(SCX)、弱酸性(WCX) 强碱性(SAX)、弱碱性(WAX) 影响萃取效率的因素——SPE分离模式的选择（与液相色谱柱相似） （三）固相萃取 影响萃取效率的因素——柱的预处理 未预处理 部分预处理 完全预处理 C18 键合硅胶的三种状态 溶剂环境良好，碳链展开，增加吸附剂和目标分析物作用的表面积 样品与吸附剂无相互作用，目标分析物未保留 为什么？ （三）固相萃取 影响萃取效率的因素——上样溶液 为了获得良好的回收率，应注意以下问题： （三）固相萃取 影响萃取效率的因素——淋洗溶剂 如何确定淋洗溶剂的浓度和体积？ 依次增加淋洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱曲线，确定淋洗溶剂合适的强度； 用5-10倍柱床体积的淋洗溶剂，依次收集和分析淋出液，得到淋洗溶剂对分析物洗脱曲线，确定淋洗溶剂合适的体积。 （三）固相萃取 影响萃取效率的因素——洗脱溶剂 选择原则 对目标分析物必须有足够的洗脱强度，以使洗脱体积较小； 必须有足够的选择性，以使目标物被洗脱下来，而杂质不被洗脱。 洗脱流速必须控制 流速慢有利于目标化合物的洗脱，但降低样品处理通量； 太快可能造成洗脱不充分； 在保证回收率的前提下，流速尽可能地快。 （三）固相萃取 方法特点 固相萃取是当前净化效果较好的一种样品制备方法！ （三）固相萃取-举例 血浆甲氧基肾上腺素类物质的样品制备 临床意义：检测嗜铬细胞瘤的存在 目标分析物：甲氧基肾上腺素（Metanephrine, MN) 甲氧基去甲肾上腺素（Normetanephrine, NMN） 存在形式： 游离形式，硫酸酯结合的形式 理化性质：极性化合物，强碱性（阳离子化合物） 3-甲氧基肾上腺素（MN） 甲氧基去甲肾上腺素（NMN） 选择具有弱阳离子和反相双重保留的SPE柱 （三）固相萃取-举例 血浆甲氧基肾上腺素类物质的样品制备流程 低离子强度用于保留 高离子强度用于洗脱 液液萃取 稀释 固相萃取 离心 过滤 样品制备技术 蛋白沉淀 临床色谱质谱实验室常用样品制备技术 衍生化 利用化学反应将生物样品中难以分析检测的目标化合物定量地转化成类似化学结构且易于分析检测的化合物，通过对衍生化产物的检测间接对目标分析物进行定性或定量分析。 （四）衍生化 邻苯二甲醛OPA衍生分离氨基酸的色谱图 条件 反应能迅速、定量地进行，反应重复性好，反应条件不苛刻，易操作； 反应的选择性高，最好只与目标化合物反应； 衍生产物只有一种，反应的副产物和过量的衍生化试剂应不干扰分离与检测； 衍生化试剂应方便易得，通用性较好。 （四）衍生化 气相色谱中常用的衍生化方法 （四）衍生化 液相色谱中常用的衍生化方法 （四）衍生化 （四）衍生化 影响因素 对于水“敏感”的