肌肉生长抑制素基因敲除肉牛的研究-动物学专业论文.docxVIP

赵丽华 赵丽华 肌肉生长抑制素基因敲除肉牛的研究 目 录 摘要 。1 ABSTRACT ．．3 缩略词表 5 第一部分：实验部分 。8 第一章牛柳7Ⅳ基因敲除打靶载体的构建 8 1材料与方法 ．8 1．1材料 一。8 1．2方法 。9 2结果 l 3 2．1和牛脚刀V基因的表达检测 13 2．2埘ZⅣ基因敲除打靶载体pPLP．MSTN的构建 14 2．3脸ZⅣ基因敲除无启动子打靶载体PIⅡ．MSTN的构建 ．．18 3讨论 ．．2 1 参考文献 ．24 附图1：解7Ⅳ基因敲除打靶载体pPLP—MSTN构建流程图 。26 附图2：旌删基因敲除无启动子打靶载体P ．MSTN构建流程图 27 第二章朋研基因敲除牛胎儿成纤维细胞的制备 。28 1材料与方法 。28 1．1材料 。28 1．2方法 29 2结果 ．34 2．1胶原酶消化法分离培养牛胎儿成纤维细胞的形态学观察 。34 2．2牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 ．35 2．3牛胎儿成纤维细胞电击参数的筛选 ．35 2．4牛胎儿成纤维细胞对G418抗药性的检测 。35 2．5基因敲除打靶载体pPLP．MSTN和PⅢ．MSTN的纯化与线性化 ．36 2．6牛胎儿成纤维细胞的转染、筛选及单克隆细胞的扩大培养 ．36 内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 2．7中靶克隆的PCR鉴定与测序分析 37 2．8牛胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 ．40 3讨论 。41 参考文献 43 附表：牛胎儿成纤维细胞在不同电击参数条件下的存活率 45 附图：跨载体P川．MSTN同源左臂PCR片段与同源重组后预期脚7Ⅳ 序列的一致性分析 46 第三章螂Ⅲ基因敲除牛胚胎的制备与移植 ．．50 l材料与方法 ．50 1．1材料 50 1．2方法 52 2结果 54 2．1卵巢卵母细胞的采集和体外成熟 ．54 2．2牛卵母细胞的孤雌激活与体外发育培养 ．54 2．3重构胚的融合与体外发育培养 ．54 2．4克隆囊胚的胚胎移植 。55 3讨‘论 55 结论 62 图版 63 第二部分：文献综述 ．70 第一章哺乳动物基因敲除技术的研究进展 。70 第二章栅刀v基因结构及功能作用的研究进展 ．．85 致 谢 ．．94 攻读学位期间发表的论文 96 赵丽华 赵丽华 肌肉生长抑制素基因敲除肉牛的研究 肌肉生长抑制素基因的敲除肉牛的研究 摘要 肌肉生长抑制素(MSTN)是特异性骨骼肌生长发育负调控因子，其活性的 丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，牛螂两基因的自然突变会引发“双 肌’’现象。相对于自然杂交育种来说，通过基因打靶技术制备转基因动物具有育 种周期短、遗传性状稳定等特点。本研究针对牛埘删基因，构建同源重组打 靶载体，对牛胎儿成纤维细胞实施电转染，进而用同源重组阳性细胞通过体细 胞核移植技术制备牛船Ⅲ基因敲除胚胎，并进行胚胎移植获得妊娠母牛。本 研究结果可为优良家畜的生产及柳两基因的功能研究奠定基础。 1．牛埘研基因敲除打靶载体的构建 构建两套用于牛姗州基因敲除的置换型打靶载体pPLP．MSTN和PIII ．MSTN。pPLP—MSTN为常规同源重组打靶载体，包含2．8kb同源短臂和4．Okb 同源长臂，具有含PGK启动子的肫D，基因作为正筛选标记；载体PⅡI—MSTN为 绿色荧光蛋白启动子捕获打靶载体，包含1．3kb同源短臂和6．8kb同源长臂，具 有无启动子的绿色荧光蛋白基因和含PGK启动子的肫∥基因作为双正筛选标 记。两套打靶载体的同源臂均克隆自和牛耳组织细胞。 2．船删基因敲除牛胎儿成纤维细胞的制备 利用线性化打靶载体pPLP．MSTN电击转染大连雪龙黑牛、和牛与鲁西黄牛 ．．／ 的胎儿成纤维细胞，经G418筛选共获得了363个G418抗性克隆，经PCR鉴 定没有发生同源重组的阳性克隆；利用线性化打靶载体PⅡI．MSTN电击转染和 1 内蒙古大学 内蒙古大学 硕士学位论文 牛与鲁西黄牛的胎儿成纤维细胞，经G418筛选分别获得了104和164个G418 抗性克隆，经荧光显微镜镜检分别获得了20和29个具有抗性的绿荧光克隆。 通过PCR鉴定与测序分析，在20个有抗性的绿荧光和牛细胞克隆中，获得一个 表达绿色荧光的栅刀v基因敲除克隆，相对打靶效率为5．00％(1／20)，绝对打 靶效率为O．27×10。7(1／3．4×107)；在29个有抗性的绿荧光鲁西黄牛细胞克隆中， 没有发现同源重组的阳性克隆。 3．姗删基因敲除牛胚胎的制备与移植 以基因敲除的牛胎儿成纤维细胞为核供体，利用核移植技术制备牛埘研基 因敲除胚胎。本研究采去核操作卵母细胞370枚，用于融合的重构胚为363枚， 融合259枚，融合率为71．3％；发育培养后获得66枚囊胚，囊胚率为25．5％。 将18枚胚胎移入12头受体，3头妊娠，妊