基因工程菌全细胞催化制备葡甘低聚糖-渔业专业论文.docxVIP

摘要葡甘低聚糖是一种水溶性的高分子多糖，它作为功能性低聚糖，可以改善动物肠道 摘要 葡甘低聚糖是一种水溶性的高分子多糖，它作为功能性低聚糖，可以改善动物肠道 微生物菌群，提高机体的免疫功能及抗氧化性等，广泛应用于食品、药品以及饲料行业。 其特殊的生理功能和广泛的应用前景，极大地引起了学者们的兴趣。本文通过含有伊 甘露聚糖酶基因的重组工程菌利用全细胞催化的方式制备葡甘低聚糖，并对其酶解工艺 条件进行响应面优化，之后对酶解产物进行薄层色谱和高效液相检测，并对酶解产物进 行脱色和去单糖处理。 Rossate．pET32a．CH3是本实验室构建的含有伊甘露聚糖酶基因的重组工程菌，酶 活力较高。该重组工程菌利用全细胞催化的方式水解魔芋粉制备葡甘低聚糖，通过单因 素优化分析，探究不同酶解温度、酶解时间、pH值、底物浓度以及加酶量对魔芋粉水 解率的影响。单因素优化结果显示，酶解反应的最佳温度为50℃，最佳时间为、12 h， 最佳pH值为7．0，最佳底物浓度为3％，最佳酶量为1000 U。由于酶解时间和加酶量这 两个因素对魔芋粉水解率的影响显著性不明显，选取反应温度(A)、底物浓度(B)、 pH值(C)为三个变量，以酶解反应的水解率Y为响应面值，利用Design．Expert软件 根据Box．Behnken的原理设计试验方案，并进行试验和统计分析，最终确定TN用全 细胞催化方式水解魔芋粉的最佳工艺条件：反应温度为50．6℃，底物浓度为3．4％，pH 值为6．8。使得最终的魔芋粉水解率达到了41．34％，与预测值41．541％相吻合。 薄层色谱法(TLC)检测具有成本低，检测速度快，操作简便等优点，因此，本研 究对酶解产物的检测采用薄层色谱法进行。根据响应面优化得到的最佳酶解工艺条件， 制备葡甘低聚糖。将反应结束后的酶解液离心取上清，与含有甘露糖、甘露二糖、甘露 三糖、甘露四糖的标准品混合液分别点样于Silica gel 60硅胶板中，进行薄层色谱分析。 分析结果显示，酶解产物中主要成分为甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖，不含有或者含 有极少量的单糖；高效液相色谱分析显示产物只占总物质含量的22．64％。 利用酵母发酵的方式去除酶解产物中含有的单糖，并通过单因素优化和正交试验优 化，探究酵母去除单糖的最佳条件。单因素优化结果显示，酵母去除单糖的最佳条件： 发酵时间为22 h，底物浓度为2％，酵母添加量为2％。经过正交试验后，优化结果显 示，这三个因素对单糖去除率影响程度逐次排序为：底物浓度(C)发酵时间(A) 万方数据 酵母添加量(B)。酵母去除单糖的最佳条件为C3AlB2，即发酵时间24 酵母添加量(B)。酵母去除单糖的最佳条件为C3AlB2，即发酵时间24 h，底物浓度 1％，酵母添加量2％。在最佳条件下，单糖去除率达到了69．50％。 利用活性炭粉末的强力、高效的吸附性对酶解产物进行脱色研究，通过单因素优化 试验探究了不同活性炭用量、脱色时间、脱色温度对活性炭脱色率和糖保留率的影响。 优化结果显示，选取0．4％的活性炭用量、lh的脱色时间、70℃的脱色温度效果较好。 在最佳条件下，活性炭的脱色率为88．53％，糖保留率为85．43％。 关键词：魔芋，葡甘低聚糖，全细胞催化，伊甘露聚糖酶，制备 万方数据 ABSTRACTGlucomannan—oligosaccharides ABSTRACT Glucomannan—oligosaccharides water-soluble polysaccharide polymers， functional oligosaccharides，which improve animal intestinal microflora，improve immune function and oxidation resistance，widely used in food，medicine and feed industry．Their special physiological functions and broad application prospects greatly aroused the interest of scholars．The glucomanno-oligosaccharides were prepared with recombinant engineered bacteriacontaining beta mannase gene by whole-cell catalysis；These enzymatic hydrolysates were detected by TLC and HPLC，bleached and processed tO remove mo