家族性房颤综合征致病基因的鉴定-药理学专业论文.docx

中文摘要型Kir2．3(12123L)质粒。(2)凝胶浓度：PCR结果的鉴定采用 中文摘要 型Kir2．3(12123L)质粒。(2)凝胶浓度：PCR结果的鉴定采用 2％的琼脂糖凝胶，SSCP分析采用12％的非变性聚丙烯酰胺 凝胶。(3)显色方法：琼脂糖凝胶EB显色，非变性聚丙烯酰 胺凝胶DNA银染显色。(4)PCR产物变性比较了三种方法： 即碱变性、SDS变性、加入甲酰胺变性上样液直接变性。(5) 实验分组：根据凝胶中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例分 为A(49：1)、B(29：1)两组，每组再根据甘油的比例(0％、 1％、5‰分三个小组，即A1、A2、A3和B1、B2、B3。(6) 电泳条件：每块凝胶选择两种电泳条件电泳，分别为30mA 恒流快速电泳和100V恒流过夜电泳。 结果：(1)选择加入变性上样液直接变性的方法变性PCR 产物。(2)确定了三种凝胶配比及该条件下适用的电泳条件。 这三种分析手段为：A2组丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比 例为49比1，凝胶中含1％甘油， 4℃，先500V高压电泳 3min，然后30mA恒流快速电泳3h；A3组丙烯酰胺与甲叉 双内烯酰胺的比例为49比1，凝胶中含5％甘油，4℃，先 500V高压电泳3min，然后30mA恒流快速电泳3h；B1组 丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29比1，凝胶中不含甘 油，4。C，先500V高压电泳3min，然后100V恒流过夜电 泳12h。(3)判断银染结果：一般情况下，一个等位基因只有 一种构象，在非变性凝胶中电泳只有一条带子。此时，在只 有1处点突变的情况下，正常个体和突变纯合个体在双链 DNA完全变性时，应该只有两条电泳条带，突变杂合子有四 条带。但是在某个温度、某种缓冲液浓度或是一定配比的凝 胶中，一个等位基因会有两种构象，在非变性凝胶中电泳就 会出现两条带子。在这种情况下，纯合子有三条带子而杂合 中文摘要子有五条。有时，由于温度和凝胶比例的不合适，所有的条 中文摘要 子有五条。有时，由于温度和凝胶比例的不合适，所有的条 带在凝胶上不能区分开，这样电泳结束后就只有一条带子。 因为我们此部分试验所用的标本不是基因组DNA而是质粒 载体装载的DNA，冈而比基冈组DNA少一对DNA双链。 “)根据实验结果，我们确定了判断SSCP的标准：如果三种 条件下，正常组和实验组银染结果均无差异，我们就认为该 段碱基无异常；如果三种条件下，止常组和实验组银染结果 有差异或是在某一个条件下有差异，我们就认为这段碱基可 能含有异常点，进一步测序判断。 小结：由于SSCP分析的高度敏感性和一些我们不明白 的原因，其结果在分析时有一些难度。在本试验中只将它做 为一种粗筛的手段，最后的结论以测序结果为准。 第二部分：筛查家族性房颤致病基因 目的：寻找该家族性房颤的致病基因，并对其致病的分 子机制进行探讨。 方法：(1)收集家系资料：(2)对家系成员进行临床诊断； (3)采集血样提取基因组DNA；(4)构建家系系谱；(5)设计特 异性引物，PCR扩增目的片段：(6)采用SSCP方法对扩增产 物进行粗筛；(7)若发现可疑基凶则纯化PCR产物进行测序； (8)将测序结果经NCBI(美国国家生物技术信息中 一t∑,)Genebank BLAST软件进行对比以发现可疑突变点；(9) 将该点与SNP数据库中收录的多态性位点进行比对，以期获 得通道突变信息。 结果：利用直接测序并结合SSCP的方法，我们共筛查 了五个钾离子通道基因，分别为KCNQl、KCNEl、KCNE2、 KCNJ2和HERG。其中完成了对KCNQl 16个外显子，和 中文摘要KCNEl、KCNE2、KCNJ2各一个外显子的全面筛查，完成 中文摘要 KCNEl、KCNE2、KCNJ2各一个外显子的全面筛查，完成 了对HERG的部分筛查。我们只在KCNQl基因上发现了一 个突变点(P448R)，该突变点为第448位氨基酸由脯氨酸突 变为了精氨酸，在筛查的钾通道基冈中没有发现基冈突变。 在所有筛查的基因中没有发现已报道的与房颤有关的基因 突变。 小结：利用分子生物学，并结合遗传学、生物信息学的 方法我们在KCNQl基因上发现了一个新的与我们掌握的家 族性房颤有关的单点突变，即KCNQl(P448R)。进一步的 通道功能研究将确证该突变是否为导致房颤发生的分子基 础。 结 论 1 SSCP是一种简单快速的筛查基因突变的方法，但在不知 道基因突变的类型和样本例数不太大的情况下，并不是最适 合的方法。 2我们在该房颤家系中发现了一个新的基因突变，即钾离 子通道KCNQl(P448R)点突变，此点突变是我们筛查的五 个钾离子通道基因中唯一的一个突变，经初步分析我们认为 KCNQl(P448R)可能与家族性房颤有关，进一步的确证需