建兰花叶病毒单克隆抗体制备及其检测应用-植物病理学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文摘要 浙江大学硕士学位论文 摘要 建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virua，CymM、r)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)是兰花上分布最广、危害最严重的两种病毒，严重影响了其经济价 值和观赏价值。本实验主要从生物学、血清学、电镜技术方面对两种病毒进行了鉴定，并 制备了建兰花叶病毒的单克隆抗体，建立了抗原包被的ACP．ELISA检测方法。研究工作 取得的主要结果如下： 1．CymMV和ORSV的鉴定 经2％磷钨酸负染和CymMV、ORSV抗血清间接ELISA方法筛选到的分别含有线状 病毒和杆状病毒粒子的蝴蝶兰病叶汁液摩擦接种藜科、茄科和葫芦科3科9种指示植物， 发现：所有被病毒侵染的植物均不显示系统症状。接种CymMV阳性兰花病叶汁液的曼 陀罗、昆诺藜只有局部坏死斑和褪绿斑，苋色藜上无症状。接种OtLSV阳性兰花病叶汁 液的苋色藜、昆诺藜呈现与曼陀罗相同的症状。两种病毒均不侵染普通烟、三生烟、珊西 烟、心叶烟、本氏烟和黄瓜。SDS．PAGE电泳蛋白分析表明，CymMV和ORSV提纯病毒 样品各自只出现一条蛋白带，分子量分别约为27kD和17kD。间接ELISA检测结果显示 两种提纯病毒与TuMV、PVX、PVY、TMV单抗均无反应。电镜下观察超薄切片，可 看到：感染CymMV的叶片细胞内有带状病毒内含体，感染ORSV叶片细胞质内有层间 倾斜排列的结晶体。此外，还进行了免疫胶体金标记。感染CymMV叶片细胞质内带状 病毒内含体上胶体金颗粒分布密集，感染0RsV的叶片细胞质内病毒内含体上也集中了 较多的胶体金颗粒，健康叶片的细胞内几乎没有金颗粒。以上结果表明我们从兰花上分离 到的两种病毒分别为CymMV和ORSV。 2．CymMV单克隆抗体的制备及其检测方法的建立 用建兰花叶病毒(CymMV)免疫的BALB／c鼠脾细胞与Sp2／O鼠骨髓瘤细胞融合， 经筛选克隆，获得2C6、587和12G9共3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体 (MAbs)的杂交瘤细胞，3株单抗都仅对CymMV有特异性反应，而与BBWV-I、BBWV-2、 CarMV、PVY、TMV、ToMV、TuMV、LSV、ToYMV和CMV等病毒均无交叉反应。 Western-blot印记分析表明，3株单抗只与CymMV的27kD外壳蛋白有特异反应。其中 587和12G9 2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达104。抗体类型及亚类鉴定显示，3 株抗体的抗体类型及亚类均为IgGl，轻链均为K链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间 接ELISA(ACP．ELISA)检测CymMV的方法，灵敏度高。病叶作1：10240倍稀释，每孔的 病毒绝对量为0．487ng时，该方法仍能检测到病毒。利用制备的单抗和建立的ACP．ELlSA 方法对浙江海宁、四川成都、浙江大学农场、北京4地的87个兰花样品进行检测，发现 有54个样品呈强阳性，阳性率高达62．1％，说明兰花上CymMV的感染率很高。 关键词：建兰花叶病毒；齿兰环斑病毒；分离；纯化；单克隆抗体；ACP．ELISA 浙江大学硕士学位论文Abstract 浙江大学硕士学位论文 Abstract Cymbidium mosaic virus(CymMV)and Odontoglossum ringspot virus(ORSVl are the most prevalent and economically important two viiuses which infect orchids and cause a lot of economic lost wortdwide．In this study,the two viruses were identified with the methods of the biology，the serology and transmission electron microscopy(TEM)．Furthermore，we prepared the monoclonal antibodies against CymMV．The pre∞n∞of CymMV in field orchids tissues was investigated with ACP—ELISA that we established． 1．Identification of CymMV and 0RSV Nine designation plants of Chenopidiaceae，Solanaceae and Cucurbitaceae were inoculated 嘶th orchids saps infect