建立RDPCR技术的体内方法研究环境致癌物对p53基因的DNA损伤-劳动与环境卫生学专业论文.docxVIP

1m!哥大学硕士学位论文 1m!哥大学硕士学位论文 建立 RDPCR 技术的体内方法研究环境孜癌物 对 p53 基因的 DNA 损伤 (捷要〉 研究生 t 熊开容 导师:衡正昌教授 B陆损伤是环境致癌过程中早骂骂可检测的关键步骤，王军检泌具有重要 的毒理学意义。我室建立的依赖随机化末端连接物 PC在 (Randomized terminal linker dependent PCR，RDPCR) 技术即可检测特定基因的 DJA 损伤。本室运用该技术已取得了一些重耍的研究结果。 RDPCR 是在 Pfeifer 等建立的连接介导聚合酶链反应 (Ligation-mediated polymerase chain reacUOZI 费 LMPCR) 及其系列技术的基础上建立的。这一系列方法部注重 子方法学的探讨，部此主要涉及的是体外实验的研究。为了拓展这一前沿 技术在毒理学研究领域的应用，必须建立其相应的体内方法。 本研究在另行设计基因特异性引物的主基础上，建立 RDPCR 技术的体内 方法:并应用 RDPCR 技术体内方法检泌置在络酸部及联苯胶对大鼠 p53 墓园 外显子 7 的 D陆损伤.!éJ注首次将 RDPC茸技术应用于 LMPCR 及其系列方法 少有涉足的体内实验的研究，更为确切地评定某些环境致癌物对特定基因 的 DNA 损伤作用:分析染毒物质的损伤热点与所致肿瘤的突变热点的关 系，探讨致突变/致癌的分子梳理。 第一部分引辖设计及她高辛辑记嚣针的制备 LMPCR 及其相关技术传统使用的放射性标记和自显影技术存在种种 不便，本研究沿用本案建立的地高辛标记的非放射性显色技术。 我们以提取的大鼠肝组织基因组 DNA 为模板，成功的应 m PCR 技术扩 四川大学硕士学位论文 四川大学硕士学位论文 增了 187峙的 p53 基因外显子 7: 通过对影响凝胶回收因素的有效控制，大大提高了 p53 基因外孩子 7 扩增产物的琼脂糖电泳纯化的回收率: 以纯化的 p53 基因外显子 7 为模板，用 PC茸法送行士远离亭的李放射性 标记 α 辛苦脂糖电泳可见泳动速度稍↑曼的 PCR 法标记探针条带。 第二部分 RDPCR 技术体内方法的建立 夜本部分的研究中，我们以重续费量铸染辛辛大鼠并提取脐组织基因组 DNA. 用基因特异性引物 1 延伸至基因组 DNA 受损的碱基位点，形成一系 列的单链扩增产物，这些产物 E宽z接与双链的具有 3 (也Linkeωe川r 〉在 T4 D阳N 战连接酶作用下连在接，然后用基因特异性引物 2 (锚 寇在引物 1上〉和连接物弓i物( Linker 的上链〉经 PCR 放大。 PCR 产物电 泳后转 Ep到尼龙膜上，然后与第一部分制备的地离辛探针杂交后显色 n 结 果显示，在 20.0 mg/kg 和 40.0mg/kg 剂量下，出现了两条清晰的杂交带， 表现窒络酸御ílJ引起大鼠姊 p53 基因外显子?的 DNA 损伤，应有两个损伤 位点。 这与 RDPCR 体外实验的结果较一致，说明我们成功地建立了 RDPCR 技术的体内方法。 第三部分阳PCR 技术体内万法检泪IJ DNA 损伤的应用 本部分我们进行阳PCR 技术体内方法的应用研究。 研究发现大鼠经联苯胶染毒后，主主济组织基因组 DNA 经 RDPCR 扩增后， 再经探针杂交显色，可在尼龙膜上出现若干的特异的杂交条错。由此说明 联苯按可能在大鼠济组织内形成了加合物并惚碍了古以聚合辈革的合成， p53 基因外显子 7 经 RDPCR 扩增后产生了若干受阻的 DNA 断片。这为阎明 联苯践诱发移就癌的分子机理提供了有益的依据，同时进一步还确了 RDPCR 体内方法的可行性。 关键诩: DNA 损伤 体内 p53 基翻 地离辛标记探针 RDPCR 2 囚川大学硕士学位论义 囚川大学硕士学位论义 PAGE PAGE 3 Establish RDPCR in vivo to detect the DNA damage of p53 gene induced by environmental carcinogen (Abstract) Postgraduate: X?ong Kairong Tutor: Pro. Heng Zhengchang DNA damage is a detectable key step during the environmental carcinogenesis and its detection has very important toxicolo gical significance. The ran