肺炎支原体耐药性及耐药机制研究内科学传染病学专业论文.docxVIP

肺炎支原体耐药性及耐药机制研究中文摘要 肺炎支原体耐药性及耐药机制研究 中文摘要 肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)属于柔膜体纲支原体科支原体属， 是有能力在体外不依靠活细胞生存、能够进行自我复制的最小微生物之一。研究 表明肺炎支原体是引起社区获得性呼吸道感染的主要病原体之一，可引起支气管 炎和非典型肺炎。 肺炎支原体生长缓慢、培养周期长、体外分离培养比较困难，国内开展相关 研究的单位很少。但只有获得肺炎支原体临床株才能进一步明确其生物学特性， 了解肺炎支原体对目前常用抗菌药物的敏感性情况，进行分子流行病学研究，并 开展新抗菌药物对肺炎支原体的药效学评价工作。 本研究建立了肺炎支原体临床株的分离培养方法，并进行连续收集和保存， 建立了菌种库。采用经改良的微量稀释法测定药物敏感性，对大环内酯类耐药株 进行了耐药机制研究和同源性分析。将Cycleave PCR技术应用于肺炎支原体及 其耐药性的快速检测。同时对肺炎支原体感染患儿的临床疗效进行了回顾性研 究。 第一部分肺炎支原体的分离培养 本部分研究建立了从临床标本中分离培养肺炎支原体的方法，分离的临床菌 株均良好保存。痰液标本来自2005年11月～2009年7月期间上海市儿童医院因 呼吸道感染住院患儿的鼻咽部吸取物。分离培养标准流程为：①呼吸道标本直接 接种于液体培养基；②37℃孵育观察颜色变化；③液体培养基≥4天变为清亮、 无混浊的黄色；④取100山加入1 ml SP4液体培养基中，37。C孵育；⑤隔日观 察，约5～7天后可再次观察到液体培养基变为清亮的黄色；⑥重复上述④⑤步骤 2-3次即可得到肺炎支原体纯种：⑦采用PCR方法进行筛选和菌种鉴定；⑧菌 种保存于一70℃及液氮中各一份。经过近五年的分离培养、纯化和冻存工作，我 们成功分离并保存了152株肺炎支原体临床分离株。临床儿童呼吸道送检标本中 肺炎支原体培养总检出率约为4．8％(152／3159)。 第二部分肺炎支原体的药物敏感性测定 目前仍没有被普遍接受的支原体药敏试验标准方法，结果判定也尚无国际统 一标准。更多学者倾向于采用微量稀释法进行支原体药物敏感性测定。文献报道 的方法是在微量孔内进行抗菌药物及培养基稀释。我们对微量稀释法进行改进， 采用试管法先将抗菌药物对倍稀释后加样至微量板，与微量板孔内稀释相比可增 加稀释的准确性。 3 本研究部分采用改良的微量稀释法测定了10种常用抗菌药物对肺炎支原体 本研究部分采用改良的微量稀释法测定了10种常用抗菌药物对肺炎支原体 临床分离株的药物敏感性。结果显示，四环素类(四环素、多西环素、米诺环素) 对肺炎支原体均具有良好的体外抗微生物活性。氟喹诺酮类中莫西沙星对肺炎支 原体具有良好的体外抗微生物活性，MIC50和MIC90均为O．06 mg／L，明显优于环 丙沙星和左氧氟沙星。肺炎支原体临床分离株对红霉素的敏感性低，MIC50和 MIC90均128 mg／L。90．1％(137／152)临床分离株对红霉素耐药，所有137株耐 药株中135株的红霉素MIC128 mg／L，2株红霉素MIC为64 mg／L。9．9％(15／152) 的肺炎支原体临床株对红霉素敏感，MIC均0．015 mg／L。肺炎支原体对阿奇霉 素和克拉霉素的敏感性也明显下降，但阿奇霉素及克拉霉素的MIC值低于红霉 素，阿奇霉素的MIC最高值为128 mg／L，无128 mg／L的菌株。本研究中16环 大环内酯类交沙霉素对肺炎支原体抗菌活性优于其他大环内酯类，MICso和 MIC90分别为4及8 mg／L。各年度肺炎支原体对红霉素的耐药率分别为，2005 年60％(3／5)，2006年82．4％(14／17)，2007年100％(24／24)，2008年80．8％(42／52)， 2009年100％(54／54)。 第三部分肺炎支原体的基因分型 上述研究表明，肺炎支原体临床分离株对大环内酯类耐药率高，达90％以上。 对于这些耐药菌是否存在克隆传播，需要进行分离株间的同源性分析以进一步明 确。本部分研究分别采用经典的限制性片段长度多态性分析(RFLP)和多重位 点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法对肺炎支原体临床分离株进行分型。 1 52株肺炎支原体临床株除2株外均可以采用PCR-RFLP方法进行分型。 92．O％(138／150)属于P1．I型，8．0％(12／150)属于P1．II型。I型中红霉素敏感 株占5．1％(7／138)，耐药株94．9％(131／138)；而II型中敏感株占66．7％(8／12)， 耐药株占33．3％(4／12)。肺炎支原体PCR-RFLP I型的耐药率明显高于II型 (x2--119．47，P0．01)。采用MLVA分型方法