第三章 基因芯片的制作方法.ppt

2.高密度的点阵技术 1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”) 3. Affymetrix独特的PM-MM探针设计 图3-11 PM-MM探针设计方案 高灵敏度 图3-12 仅用PM探针与联合应用PM-MM 探针检测靶序列的灵敏度比较 芯片结果准确可靠 图3-13 PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较 4. 光导原位合成法的缺点 需要避光掩膜，造价高； 光脱保护方式，造成光衍射，制约探针密度的提高 对研究者而言，每次实验只是使用芯片探针的一部分，探针浪费严重 羟基 硫醇基 * 这张图是Affy完整的操作平台，包括…… 整个系统是一个完整的封闭的体系，Affy芯片只能在这套系统中进行检测，这一套仪器系统也只能操作Affy芯片。Affy公司在全球使用统一的平台，芯片以及软件，有利于全球的研究者进行数据的比较以及研究结果的共享。Affy的核心就是基因芯片，下面看一下： 个人实验室和公司一般制备的是cDNA芯片，是提取正常和异常的RNA，反转录成cDNA，然后标记Cy3和Cy5，，然后杂交到相同芯片上，根据荧光强度判断表达的高低。Affy是原位合成的寡核苷酸芯片 * 下面一一看一下这些特点，首先看一下核心的专利技术：光蚀刻原位合成技术 * 这张图是合成原理图： 首先使固相片基羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，然后选取适当的避光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其他部位不透光。这样，当光通过避光膜照射到支持物上时，受光部位的羟基就会发生脱保护而活化，被激发掉，暴露出羟基，从而可以反应结合碱基。由于参与合成的碱基单体一端可以进行固相合成，另一端受光敏基团的保护，所以原位合成后，可进行下一轮的光照、脱保护和固相合成。这样不停的循环下去，不断改变避光膜的透光位点，就可以实现在同一玻片上合成成千上万种预定序列的寡核苷酸探针。 B是一张合成的立体图像，主要通过避光膜改变位点合成 * 点阵密度非常高，这种密度是国内外其它公司的芯片是无法比拟的 * 下面看一下Affy公司非常独特的探针设计 因芯片杂交的灵敏度和特异性是芯片技术的核心，Affymetrix在探讨了各种各样的影响因素后，设计出了一种独特的PM-MM探针方案（见下图）。芯片上的每一个基因或EST都是由一个或几个探针组(probe set)组成，每组探针组又由11-20对25mer的探针对(probe pair)组成，每探针对包括两个探针池(probe cell)，其中一个是完全匹配（Perfect-Match，PM）的，另外一个是序列中间有一个碱基错配的(Mis-match, MM)。 这11-20对探针对不是完整地排列在芯片上，而是打散在不同的位置，这样可以避免芯片的某一个部位出现问题对整个探针组的影响。 这种非常独特的探针设计大大提高了探针的特异性和灵敏度。 先来看一下对特异性的影响 * * 设计了多段短的探针表示同一个基因，这样可以有效区分同源基因，重叠基因，或者同源M mRNA不同的碱基，从而提高了芯片探针的特异性。 cDNA是用单一的序列代表一个基因，很难区分同源序列非常高的基因 * 这张图是单独使用PM探针和联合使用PM-MM探针对灵敏度的影响。横坐标表示样品的浓度，从0.01到1024pm，纵坐标表示信号值，红色的是表示单独使用PM探针，那么可以发现，当浓度在2以下时，信号值对浓度的反应不灵敏，基本上都处于7这个位置。而我们如果使用联合的探针，尽管浓度值在2以下，反应仍然十分灵敏，浓度低，信号也低，说明联合使用PM-MM探针可以大大提高探针的灵敏度。在Affy芯片中，最高的灵敏度可以达到1：30万。灵敏度提高的好处是，一方面面可以节省样本，只需要5-10ug的总RNA；另一方面可以检测出低丰度表达的基因。 在PM-MM探针设计中，MM探针是有效的内参照，它们与PM探针一样可以和非特异性序列结合，这样，就可以将不同来源的样品中的背景信号有效的定量扣除。这种独特的设计对于区分特异性和非特异性杂交是相当灵敏的。比较那些单一的基因探针来说，PM-MM探针的高特异性和灵敏度更适合检测低丰度表达的基因。如上图所示，将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中，在组织样品中是不含有原始的克隆转录产物的。经过标记的样品与Affymetrix Genechip人类基因组芯片杂交，在克隆转录产物浓度低于8pM时，PM单独探针无法探测出相应的浓度变化，而与MM探针联合使用则可以探测出。PM-MM探针对的使用可以探测出的样品中转录物的范围为1:100,000-1:300,000。PM-MM探针对照设计可提高对复杂背景特异性检测，使得灵敏度与特异性之间达到一个优化的平衡。 原因：杂交不能达到反应完全，即反应不能达到平衡 * 因为有多个探针设计，可以有多个参照进行分