干扰素膜蛋白(IFITM)Tet-on系统稳定细胞系的建立及其抗CA16病毒的初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘 要 摘 要 背景：手足口病是一种常见的儿童传染性疾病，该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破 溃后形成溃疡为主要临床症状，可引起少数患儿产生心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎 等并发症，病情发展过快严重时会导致患儿死亡，目前仍然没有有效的预防措施及治疗 手段。IFITM 是一种干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，其对多种病毒均具有很好的抑制作 用。因此，研究其对手足口病主要病毒 CA16 的抗病毒作用可为今后的预防及治疗提供 理论依据。 方法：通过 Tet-on 调控系统，构建了受强力霉素诱导表达 ifitm1/2/3 基因的 HeLa 细胞系，并初步探索了其对柯萨奇病毒 A16（CA16）的抑制作用。首先将调控质粒 pTet-on 转染进入 HeLa 细胞，通过 G418 筛选出阳性克隆细胞系，在此细胞系基础上共同转染 反应质粒 pTRE2-IFITM1/2/3 和伴侣质粒 pTK-Hyg，通过潮霉素筛选出单克隆细胞系， 加入强力霉素后 Western Blotting 筛选出可诱导表达 IFITM1/2/3 蛋白的单克隆细胞系。 使用实时荧光定量 PCR (RT-qPCR)检测强力霉素诱导表达的 IFITM 蛋白对不同感染复 数(multiplicity of infection, MOI)的 CA16 的抑制作用。 结果：成功构建了受强力霉素诱导表达的 IFITM 细胞系，细胞感染不同 MOI CA16 病毒，Realtime PCR 结果显示 IFITM 蛋白对 CA16 病毒具有很好的抑制作用，其中 IFITM 3 的抑制效果最为明显。 结论：Tet 调控 ifitm1/2/3 基因表达 HeLa 细胞系的成功建立，为进一步研究 ifitm 基 因的功能及其抗病毒机理提供了一个理想的细胞模型，同时也为手足口病的今后深入研 究提供理论依据。 关键词：干扰素诱导膜蛋白；细胞系；柯萨奇病毒 A16 I Abstract Abstract Background: Hand, foot, and mouth disease（HFMD）is a common viral illness among infants and young children, with clinical characterization of prodromal fever followed by pharyngitis, mouth ulcers, and a rash on the hands and feet. Acute infection may also cause severe neurological disease such as encephalitis and meningitis that leads to significant mortality. Clinically, so far, no prophylactic or therapeutic method is available to treat HFMD. IFITM is an interferon stimulated protein that restricted many virus replication. These urgent issues and the potential for an HFMD pandemic in the future prompte us to exploit a more effective approach to combat CA16 virus. Methods: At first, plasmid pTet-on was transfected and sifted by G418 to generate HeLa-tet cell line. Then, each pTRE2-IFITM plasmid companied with pTK-Hyg plasmid was cotransfected into positive clones followed by hygromycin B selection to generate HeLa/Tet/pTRE2-IFITM1/2/3 cells. The positive cell line was verified by Western Blotting analysis to detect the expression of IFITM1/2/3 proteins after doxycycline treatment. Results: Controllable IFITM-expressing HeLa cell line was infected with dif