荧光定量PCR方法检测轮状病毒感染单位课件.pptVIP

Blast 分析 4. 反应体系 试剂 使用量 (μL) 使用量 (μL) 终浓度 2×One Step RT-PCR BufferⅢ 12.5 25 TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl） 0.5 1 PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 1 PCR 正向引物（10 μM） 0.5 1 0.2 μM PCR 反向引物（10 μM） 0.5 1 0.2 μM 探针 1 2 0.2 μM ROX Reference Dye（50×） 0.5 1 RNA样本 5 10 DEPC水 4 8 Total 25 50 RNA样本：将15μL裂解液加入到585μL DEPC水中(1:40稀释) *ABI 7300:31秒 循环参数 5.病毒收获时间的确定 不同时间点收获的G1, G2, G3, G4和P1五种血清型病毒液中病毒mRNA的CT值 Ranheim T, Mathis PK, Joelsson DB, et al. J Virol Methods. 2006, 131 (2): 193-201. 6.与TCID50法进行比较 Ranheim T, Mathis PK, Joelsson DB, et al. J Virol Methods. 2006, 131 (2): 193-201. 7.多批检测 Ranheim T, Mathis PK, Joelsson DB, et al. J Virol Methods. 2006, 131 (2): 193-201. 8. 总结 采用血清型特异的引物和探针可检测配比后多价病毒中每个血清型轮状病毒的感染单位； 荧光定量PCR方法具有较高的灵敏性和特异性，并适于高通量的检测； 该法与传统的免疫荧光方法比较在方法的建立和以后的检测中可节约时间、降低成本，并可降低主观因素对结果判定的影响。 实验设计的可行性 是否需要建立内参照，能否可将阴性对照近似认 为内参照 多通道检测的可行性 8. 问题 8. 指导和建议 * 荧光定量PCR方法检测配比后各血清型轮状病毒感染单位 实时荧光定量PCR方法介绍 1. 实时荧光定量PCR定义 2. 与普通PCR的区别 3. 荧光定量PCR扩增的四个阶段 4. 荧光阈值和CT值的定义 5. 定量PCR的数学原理 6. 荧光定量PCR化学原理 检测配比后多价血清型轮状病毒感染单位 1.实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。 2.与普通PCR的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量 3.荧光定量PCR扩增的四个阶段 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 4.荧光阈值和CT值的定义 CT值 5.定量PCR的数学原理 即Ct=-K LogX0+b (线性方程) 6.荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记：SYBR Green 特异性荧光标记：TaqMan、MGB等 Taqman 探针原理 实时荧光定量PCR方法介绍 1. 实时荧光定量PCR定义 2. 与普通PCR的区别 3. 荧光定量PCR扩增的四个阶段 4. 荧光阈值和CT值的定义 5. 定量PCR的数学原理 6. 荧光定量PCR化学原理 检测配比后多价血清型轮状病毒感染单位 1.实验流程 2. 定量检测核酸类型 3. 引物、探针设计 4. 反应体系的确定 5. 病毒收获时间的确定 6. 与TCID50方法比较 7. 多批检测 8. 总结 1.实验流程 种MA-104细胞至96孔板 待细胞长至单层，病毒激活并吸附1 h 用PBS洗板2-3次 40μl 无血清培养基(1%胰酶)培养23-24 h 每孔加入10μl Triton X-100，冻融一次，裂解细胞 一步法实时荧光定量PCR反应 数据分析 血清型A 107 106 105 104 标准品 10-1 原液 样本 对照 阴性 空白 阳性RNA对照 血清型B 血清型C 血