第五章.分子生物学的研究方法-电泳、杂交PPT.ppt

;序：重组DNA技术回顾;3;2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制;3、50年代末和60年代:“中心法则”、操纵子学说、破译遗传密码;重组DNA技术的定义及步骤;指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆（molecular cloning）：构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系。;重组DNA技术的一般步骤;第一节 DNA基本操作技术——一、 DNA提取分离;3. 溶液III：3mol／L NaAc（pH4.8）溶液(质粒DNA） 调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。 高盐有利于染色体DNA、RNA（中和核酸上的电荷）以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀（钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物）。 4．无水乙醇沉淀DNA：一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇。 5．NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25 mol/L： 中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力。 ;6．RNase、SDS与KAc/饱和酚、氯仿：SDS可使RNase成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物。 7．T-E缓冲液:DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等都可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀. 8.Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统:不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳 ;二、核酸的凝胶电泳;1 原理;2 琼脂糖凝胶电泳;不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 ;电泳槽结构;电泳装置;常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.;溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 红色荧光;溴化乙锭染色;22;银染;LMP琼脂糖回收DNA分子;25;变性胶电泳;27;3 脉冲电场凝胶电泳;“电泳”思考题;三、 核酸分子杂交;1 Southern blot;Southern blot原理模式;Southern blot转移装置图;34;35;探针制备及标记;DNA聚合酶法制备探针;随机引物法制备探针;1）. 生物素标记核酸探针 Bio-lldUTP、Bio-7dATP、Bio-11-dCTP、Bio-16-dUTP等。;40;41;42;43;44;2 Northern blot; 上 样 预处理 RNA （up to 30μg）4.5μl+5×buf 2.0μl 甲醛 3.5 μl 甲酰胺 10 μl 65℃ 15min loading buf 50%甘油，1mM EDTA（pH 8.0） 0.25% BPB 0.255 二甲苯 TFF ? 电 泳 loading之前，预电泳5min 5V/cm 电泳1-2hr之后，混合正负极电泳液 ; 转 膜 预处理 DEPC H2O洗涤去除甲醛 如果胶浓度10% 或 厚度0.5cm 或 底物2.5kb，需用0.05M NaOH处理20min，部分水解RNA 无RNase H2O洗涤，20×SSC浸泡45min 转移，同Southern;3 Western blot; 简要步骤 制备样品 SDS样品 蛋白质转移 硝酸纤维素滤膜，电转移：三夹板/隔离电极板；干燥 染色 丽春红S or 印度墨水（射启性检测适用） 但现少采用，由于有prestain MW marker ; 封闭背景 脱脂奶粉 5% 第一抗体与靶蛋白结合 二级免疫反应 抗免疫球蛋白抗体或A 蛋白? 标记：125I 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 偶联 A蛋白可与IgG的Fc片段binding? 木瓜蛋白酶切割IgG Fragment antigen binding， Fragment crystalline;4 原位杂交：菌落杂交和空斑杂交;5 斑点杂交;思考题