第五章 PCRPPTPPT.pptVIP

聚合酶链式反应（PCR）;一、基因扩增;1.环境诱发扩增 在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲 喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。 2. 基因的程序性扩增 在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾 卵子形成过程中rRNA基因的扩增。 3. 基因组进化扩增 生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果 相关的基因聚集成簇。 4. 基因工程扩增 载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。 5. PCR扩增 应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。;二、PCR技术Polymerase Chain Reaction;2. PCR技术的原理：;（3）DNA链的延伸 DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。72℃ ;;;3. PCR的过程;4. PCR的特点;5. 影响 PCR的因素;③ Taq酶的功能缺点 具有5’?3’聚合酶活性和5’?3’外切酶活性，但没有3‘?5’外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 ④ Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。;（2）其它耐热的 DNA聚合酶 ①Tth DNA聚合酶 无3’ ? 5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录 cDNA，又能扩增DNA。 ②VENT DNA聚合酶 有3‘?5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受 100℃高温。 ③ Pfu DNA Polymerase 有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。是目前已 发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但 PCR产物为平端！ ④ Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。 Taq的PCR产物 3’端往往带有一个A。 ;（3）引物（primer) ①位置：与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。 ②引物的长度 理论计算：419=2.75?1011。即2.75?1011 bp的基 因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会。 一般引物设计为长15—30bp。 ;③引物的碱基序列 3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。 ;④引物的碱基组成;3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 ;⑤引物的Tm值 手工计算：Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55℃。实际复性温度选择低于Tm值5℃。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.5?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。;;（4）模板（template) ① 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量：不能太多，100?l反应体系中100ng足够。;（5）dNTPs dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。一般反应体系中dNTP混合液浓度2.5mM each。浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 （6）Mg 2+ 的浓度 Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。;6. PCR技术的扩展;;荧光探针和荧光染料 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。;SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大