第4章 基因组测序与序列组装3+1陈竺PPT.ppt

第四章 基因组测序与序列组装; 1、DNA测序的方法 链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序;1.1 链终止法测序 (the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。;（一）DNA的酶法测序（双脱氧终止法）;1971年，吴瑞将引物延伸（primer extension）用于DNA测序。 吴瑞发明的联接子（linker）和衔接子（adaptor）迄今仍然是克隆DNA的常用工具 他主编的《重组DNA》曾风靡分子生物学和生物技术界。 上世纪80年代后，吴瑞在水稻转基因技术上有先导性贡献。;对DNA聚合酶的要求; 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶;;3→5外切酶活性──校对作用 这种酶活性的主要功能是从3→5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 ;5→3外切酶活性──切除修复作用 从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5’-脱氧核苷酸。;A 克隆于质粒中DNA;C 噬粒克隆DNA;;对引物的要求;;;;;1.2 化学降解法测序 基本原理: 在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.;技术路线;Maxam-Gilbert 法所用的化学技术;化学法测序实例;1.3 自动化测序;DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP;;120台毛细管电泳装置24小时连续作业，一天工作量是1亿个碱基长度的DNA，4天就可测完水稻基因组;光点测序;DNA芯片测序;利用基因芯片进行杂交测序的原理;2、基因组测序;2、基因组测序;基因组测序覆盖面：随机测序获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆盖面越大，遗漏的序列越少。;序列间隙：测序时遗漏的序列。;2.3序列间隙和物理间隙;;2.4插入片段的两端测序;3 序列的组装;A;实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装Cerala genomics公司 1995; 各重叠群间仍有间隙(139个) 序列间隙（99个） 物理间隙（23个） ↓ ↓ ;;3.2 指导测序与序列组装;; 先将染色体打成比较大的片段(几十-几百Kb), 利用分子标记将这些大片段排成重叠的克隆群(Contig), 分别测序后拼装. 这种策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.;;两种策略的比较;3.4 其他测序路线;;EST (Expressed sequence tag) 测序;;4.人类基因组计划; A. Celera Genomics 人类基因组的测序策略 ;采集5个自愿者的DNA样品;B 国际人类基因组测序策略 构建BAC克隆 ↓ 限制性酶处理获得指纹 ↓ 根据指纹重叠方法组建BAC克隆重叠群 ↓ 根据STS标记,将BAC克隆重叠群标定在物理图上 ↓ 每个BAC克隆内部采用鸟枪法测序,组装 ↓ 将BAC插入顺序与BAC克隆指纹及重叠群比对,将已阅读的顺序锚定到物理图上;;4.2 人类基因组测序结果;人类基因组研究的惊人发现;人类基因组研究的惊人发现; 人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异。 在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。 ;4.3 人类基因组计划的伦理学;5. 后人类基因组计划;6 水稻的基因组