第五章分子研究方法PPT.ppt

现 嫌1 嫌2 嫌3 四、SNP技术及其应用 英文缩写 英文名称 中文名称 RFLP Restriction fragment Iength polymorphism 限制性片段长度多态性 STS Sequence tagged site 序列标签位点 RAPD Random amplified polymor- Phic DNA 随机扩增多态性DNA AFLP Amplified frangment length Polymorphism 扩增片断长度多态性 SSR Simple sequence repeat 简单序列重复 SNP Simple mucleotide polymor- phism 单核苷酸多态性 主要的ＤＮＡ分子标记 (一)RFLP限制性片段长度多态性 不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因产生碱基突变后，改变 了某种 限制性内切酶的剪切位点，使此酶在该位点不能剪切，形成了长度不等的限制性片段。这些 限制性片段在人类不同个体间呈现的多态性现象称为限制片段长度多态性. RFLP 提取DNA 酶切DNA 凝胶电泳分开DNA 片段 DNA 转移到滤膜上 放射性标记的探针显示特 的DNA 片段 RFLP基本步骤 同一物种不同生态型之间DNA的趋异性的RFLP GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI EcoRI EcoRI 生态型A的DNA: 基因A 生态型B的DNA: GAATTC CTTAAG GGATTC CCTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI EcoRI 从每个生态型分离的DNA分别用EcoRI限制酶切割 琼脂糖凝胶电泳后作Southern杂交 同放射性同位素标记的基因A克隆杂交 放射自显影照片 A T .. G C … to 取代 (a) (b) (二) SNP 单核苷酸多态性 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性. 只涉及到单个碱基的变异(转换或颠换)，也可由碱基的插入或缺失所致。 single nucleotide polymorphism 99.9%的一致性，0.1％的差异 研究者从志愿者身上取得了DNA样本，这些志愿者分别是欧洲、非洲和中国人的后裔。 基因编码区SNP（cSNP） 基因周边SNP（pSNP） 基因间SNP (iSNP) 第三节 基因克隆技术简介 三、酵母单杂交法 1、 原理 (1) 转录因子的两个主要结构域： a. DNA结合域-DNA binding domain，简称DNA-BD，它可识别效应基因上游的一段特定的区段， 即上游激活序列(up-stream activating sequence, UAS)，并与之结合。 b. 转录激活域-Transcriptional activation domain，简称AD，它通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。 ATG TAA 5’UTR 3’UTR 转录终止位点 RNA起点 核糖体结合位点 转录 转录区 启动子 终止子 基因 图1 一种典型的原核蛋白质编码基因的结构示意图 基因的编码区(即转录区)是连续不断的序列，包括一个起始密码子ATG和一个终止密码子TAA。编码区的两侧是转录而不转译的侧翼序列区，其中5’非翻译区简称5’UTR，含有一个核糖体结合位点及一个转录起始信号；3’非翻译区简称3’UTR，含有一个转录终止信号。 ATG TAA 5’UTR 3’UTR 多聚腺苷酸位点 RNA起点 转录区 启动子 终止子 基因 初级RNA转录本 图2 一种典型的真核蛋白质编码基因的结构示意图 与原核的蛋白质编码基因相比，最主要的特点是转录区的编码序列是间断的、不连续的，其中编码氨基酸的序列叫做表达子(exon)，非编码序列则叫做间隔子(intron)。转录产生的初级RNA转录本，经过剪辑加工(即去掉间隔子)后，形成功能的mRNA分子。 转录 ③、在目的基因外侧线性化重组载体，并将一个阴性筛选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性筛选标志基因、阴性筛选标志基因。 在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志