第二章 生物化学技术原理及其应用-1PPT.ppt

生物化学技术原理及其应用;原理？;基本理论：;第一章 生命大分子物质的制备 ;目的;第一节 材料的选择;有效成分含量多； 稳定性好； 来源丰富； 保持新鲜； 提取工艺简单； 有综合利用价值. ;所选用的材料主要依据实验目的来确定； 根据常用的动物、植物和微生物材料的特点各异，所以材料处理的要求也不同. ;1．动物脏器?;(1) 冰冻：;人工剥去脏器外的脂肪组织； 浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂； 采用快速加热(500 C左右)、快速冷却的方法、使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去； 利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。;对于像脑下垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用； 对于含耐高温有效成分(如肝素)的肠粘膜，可在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。;2．植物组织;? 3. 微生物;? 培养液 收集上清 菌 体 有效成分 有效成分 (低温下短时间储存) (干粉，40C保存);第二节? 细胞的破碎;一、机械破碎; 剧烈的破碎细胞方法。捣碎器(转速8000一10000r／min)处理30一45秒，植物和动物细胞能完全破碎。 如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时，就须加入石英砂才有效，但是在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性。因此捣碎的时间不易太长。; 它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。细菌和酵母菌悬浊液用超声波处理时,时间宜长点。有些菌体破碎要5-10分钟，或更长。如果在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。;; 此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用1.77×108-3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(＜细胞直径的孔)．致使其被挤破、压碎。 如高压细胞破碎机.; 将细胞置低温下冰冻一定时问，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 ;二、溶胀和自溶;细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。 应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不???可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可把某些有效成分在自溶时分解。;三、化学处理;四、生物酶降解;;第三节 抽 提;1）对有效成分溶解度大，破坏作用小； 2）对杂质不溶解或溶解度很小； 3）来源广泛、价格低廉、操作安全等。; pH值 溶剂的极性和离子强度 水解酶 温度和搅拌 氧化 金属离子; 1、pH值;例如： 肝素在酸性pH范围内易受破坏，且不易与脂蛋白分开，而在碱性pH范围内，蛋白质带负电荷，不能与带强负电荷的肝素形成离子键而解离。故采用pH10.5-11的高碱性溶液抽提，效果较好.;注意： 若在抽提阶段需用弱碱(NH4OH)或弱酸(HAC)控制粗匀浆液的pH值时，注意搅拌，避免局部出现过高的酸、碱浓度，导致所需物质变性； 有些抽提过程的最适pH值与使有效成分的活性稳定的pH值并不一致。;2、溶剂的极性和离子强度;例如： 提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2mo1/L蔗糖水溶液．才能达到抽提目的。;降低极性的方法： 在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度； 若用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时，会使溶液的极性大大降低； 在水溶液中加入中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和(NH4)2SO4能提高溶液的离子强度。;一般而言 离子强度较低的中性盐溶液促进蛋白质溶解(盐溶)，保护蛋白质活性的作用； 离子强度过高则引起蛋白质发生盐析作用. ;3、水解酶; 4、温度; 5、搅拌; 6、氧化;在抽提液中加入： 1）β-巯基乙醇（1-5mmol/L) 2）半胱氨酸(5-20mmo1/L) 3)还原谷胱甘肽 4)巯基乙酸盐(1-5mmo1/L)等还原剂 可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。; 7、金属离子; 8、抽提液与抽提物的比例;第四节 浓 缩; 在抽提液中加入适量的中性盐，如硫酸铵[(NH4)2SO4]或有机溶剂，使有效成分变为沉淀。经离心或过滤收集的沉淀物，加少量缓冲液溶解后，再经离心除去不溶物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。;将干葡聚糖凝胶G25(或吸水棒)加入抽提液中，两者比例为1:5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右．回收蛋白质量约80％。 当凝胶(或吸水棒)对有效成分吸附力强或吸水后对有效成分的性质有影响时。此法不宜采用。; 把抽提液装入超过滤装置(见图)，在空气或