原生质体培养PPT课件.pptVIP

一、原生质体概念 二、原生质体培养意义： 第一节 原生质体的分离与纯化 （四）分离方法 二、原生质体的纯化 第二节 原生质体培养 二、培养方法 2、平板法培养 原生质体（密度为4×105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养—5-7天原生质体开始分裂 特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。 3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。 特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的培养对比试验，进行单细胞培养。 4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。 特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。 5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。 三、原生质体存活率、密度及产量的测定 （一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100 （二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）×104×稀释倍数 （三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW Y（个/g）——原生质体产量 D（个/ml）——存活原生质体密度 V（ml）——制备所得原生质体悬液的总体积 FW（g）——制备原生质体所用材料的鲜重 四、影响原生质体培养的因素 1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过高。 2、原生质体起始密度 一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降低培养密度。 3、渗透压稳定剂 在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外，还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或部分取代甘露醇，效果也很高。 五、影响原生质体培养的因素 4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比： 5、培养条件 光照：原生质体培养初期不需要光照，采用暗培养，当形成细胞团后在光下培养，强光抑制细胞分裂 温度:26±1℃ 6、植物材料和基因型 第三节 原生质体融合  也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体，在人工控制下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。 自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。 二、原生质体融合的方法和过程（一）无机盐诱导融合 硝酸钠（二）聚乙二醇（PEG）诱导剂与高钙相结合的诱导融合 1、PEG诱导剂溶液配制：分子量为4000-6000。 2、高Ca2+-高PH液 3、原生质体培养基：NT与MS 原生质体融合 甘薯原生质体融合植株 * * 第八章 原生质体培养 目的与要求 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。 具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。 原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。 1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。 2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。 一、原生质体的分离 （一） 植物细胞壁的结构及其化学组成 1、植物细胞壁：初生壁：纤维素、半纤维素