鸭圆环病毒cap基因的表达与检测cap抗体的间接elisa方法建立-expression of cap gene of duck circovirus and establishment of indirect elisa for detection of cap antibody.docxVIP

摘 要鸭圆环病毒（duck circovirus，DuCV）是圆环病毒科圆环病毒属的成员之一， 主要引起宿主的淋巴系统损伤，导致免疫抑制，进而引起继发感染或二重及多重感染， 已引起越来越多的关注。美国、匈牙利、德国和中国台湾等地区相继报道在番鸭、半 番鸭、樱桃谷肉鸭中发现该病毒。国内福建、山东、浙江和广州等省份的流行病学调 查，也证实了 DuCV 的普遍存在。DuCVcap 蛋白是 DuCV 的主要的免疫原性蛋白，也是病毒的主要结构蛋白。为了能够得到 DuCV 的免疫原性蛋白，并以此建立诊断方法，为鸭场大规模样品中检测 DuCV 抗体提供依据。研究用 DuCVcap 基因原核表达蛋白，并进行纯化，建立间接 ELISA 方法，初步应用于安徽省部分鸭场 DuCV 抗体检测。具体如下：首先利用软件对 DuCVAQ0901 株 cap 基因的保守区域进行分析，设计了一条特异性引物，将 N 末端影响外源蛋白表达的稀有密码子截去后，将其克隆到原核表达 载体 PET-28a 中，并在完成对构建质粒 PCR、EcoRⅠ/SalⅠ双酶切鉴定，测序鉴定后， 用诱导剂 IPTG 对其进行诱导表达，同时对诱导剂浓度，诱导时间，蛋白表达的可溶 性等条件进行优化。在大量表达重组 dcap 蛋白后，利用 NI 纯化树脂对 His-dcap 蛋白 进行纯化，同时还对重组蛋白的浓度，纯度以及免疫活性等特性进行检测，并用纯化 好蛋白免疫健康樱桃谷肉鸭，制备了 多克隆抗体血清。结果显示，构建好的 pET-28a-dcap 重组质粒诱导表达后，经 SDS检测及 Western-blot 分析证明，在 大肠杆菌中得到了高效表达，并以包涵体的形式表达；用 NI 纯化树脂对 His-dcap 蛋 白进行纯化后，蛋白浓度可达 1.285mg/mL，且表达蛋白保留了部分天然 cap 蛋白的 抗原性；利用纯化蛋白乳化后制备多克隆抗体血清经琼扩试验测定抗体效价可达 1∶128。其次利用上述纯化好 dcap 蛋白建立一种检测 cap 抗体的间接 ELISA 方法，为规 模化鸭场 DuCV 感染情况调查提供快速简易的血清学方法。即利用纯化好的蛋白(dcap) 作为包被抗原，制备 cap 抗体阴阳性血清，用矩阵法筛选最佳工作浓度，同时也对抗 原包被时间、一抗孵育时间、二抗反应时间、底物显色时间等条件优化确定，计算出 阴阳性血清临界值及结果判定方法。并用此方法对安徽省部分鸭场采集血清进行了 DuCV 抗体检测。用纯化 cap 蛋白包被酶标板，建立特异性检测 cap 抗体的间接 ELISA 方法。确定该方法蛋白最佳包被量为 6.57 μg/mL，血清最佳稀释度为 l∶80，阴阳 性临界值为 0.391。抗原最佳包被时间为 4℃过夜，一抗孵育、二抗反应、底物显色 最佳时间分别为 1h，1h，15min。并用建立的间接 ELISA 方法，对安徽部分地区收 集的 338 份鸭血清样品进行 cap 抗体检测，结果检出阳性率为 26.9％，证明了安徽部I分地区鸭场中 DuCV 的感染普遍存在。用生物统计学方法对结果进行分析，显示安徽省部分地区鸭群中以樱桃谷肉鸭的 DuCV 感染率较高；不同日龄段的鸭群中 DuCV 的感染情况，以 30-60 日龄段高于其它日龄段；不同地区间 DuCV 阳性检出率也存在 着一定程度的差异。上述结果证实建立的间接 ELISA 方法可用于大规模样品的临床检测，为鸭圆环 病毒病流行病学的调查和下一步 ELISA 检测试剂盒的开发奠定了基础，对鸭圆环病 毒病的诊断与疫苗的研究有较大的意义。关键词：鸭圆环病毒，cap 基因，原核表达，间接 ELISA 方法AbstractDuck circoviros(DuCV), which damages the hosts lymphatic system, is one number of the Circovirus in Cireoviridae. It induces immunosuppression mainly, and then gives rise to secondary infection or multiple infection. DuCV has catched more and more attention. Up to now, the DuCV has been found and describes in several duck species such as Cairna moschata, Muscovy duck, and Pekin-ducks in America; Hungaru; Germany;Taiwan etc, and its also widespread in FuJian、