鸭坦布苏病毒e蛋白单克隆抗体制备及间接elisa方法建立-preparation of monoclonal antibody against duck tembusu virus e protein and establishment of indirect elisa method.docxVIP

目录1引言 11.1病原学 11.1.1鸭坦布苏病毒的形态结构及理化特性 11.1.2基因组结构及特点 11.1.3基因组编码蛋白的生物学功能与特性 21.1.4 E 蛋白表位研究 51.2流行病学 51.3DTMUV 的致病机制 61.4症状和病变 6DTMU 的诊断 71.5.1病毒分离鉴定 71.5.2血清学诊断方法 71.5.3抗原检测方法 8DTMU 的预防 10ELISA 技术概述 10ELISA 技术原理 10ELISA 技术的特点 111.7.3ELISA 技术在 DTMUV 检测中以及其它动物疾病及安全检测的应用 111.8单克隆抗体技术概述 111.8.1单克隆抗体技术的原理 121.8.2单克隆抗体制备的技术路线 121.8.3单克隆抗体技术的特点 131.8.4单克隆抗体技术在鸭坦布苏病毒（DTMUV）研究中的应用131.9本文研究的目的和意义 142实验一鸭坦布苏病毒 E 蛋白基因的原核表达152.1材料与方法 152.1.1材料 152.1.2方法 152.2结果与分析 192.2.1PCR 扩增192.2.2重组表达载体的构建 19SDS分析20Western- blot 分析 202.2.5融和蛋白 E 的大量表达及纯化 212.3讨论 213实验二 鸭坦布苏病毒抗体间接 ELISA 检测方法的建立 233.1材料与方法 233.1.1材料 233.1.2方法 233.2结果 253.2.1纯化的 DTMUV 蛋白定量253.2.2抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 253.2.3抗原最佳包被条件的确定 263.2.4酶标二抗最佳工作浓度的确定 263.2.5酶标二抗最佳作用时间 273.2.6间接 ELISA 阴阳性临界值的确定273.2.7特异性试验 283.2.8敏感性试验 283.2.9重复性试验 293.2.10对比试验 313.3讨论 314实验三 鸭坦布苏病毒 E 蛋白中和性单克隆抗体的制备334.1材料与方法 334.1.1材料 334.1.2方法 334.2结果 384.2.1抗原的制备 384.2.2间接 ELISA 检测方法最佳工作条件的建立384.2.3免疫小鼠抗体水平的检测 384.2.4饲养细胞的制备 394.2.5骨髓瘤细胞的制备 394.2.6细胞融合和杂交瘤细胞的建立 394.2.7杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定 394.2.8单克隆抗体的特性鉴定 404.3讨论 424.3.1制备单克隆抗体的重要性： 424.3.2制备单克隆抗体过程中的关键环节 434.3.3所制备 DTMUV E 蛋白单克隆抗体潜在的应用价值： 434.3.4有关多克隆抗体与单克隆抗体的纯化 445结论 44致谢 45参考文献 45作者简介 461 引言鸭坦布苏病毒病是黄病毒科黄病毒属坦布苏病毒（Duck tembus Virus，DTMUV） 引起的以鸭死亡和蛋鸭产蛋下降为特征的新发传染病。该病最早于 2010 年 4 月在我 国华东地区首次爆发，并迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏、广东、山东、河南、 河北、江西等主要鸭养殖地区，导致我国养鸭业遭受了巨大经济损失。坦布苏病毒最初是从泰国和马来西亚的库蚊和伊蚊体中分离到的，迄今，有关坦 布苏病毒引起动物疫病的报道非常有限，唯一的报道是 Sitiawan 病毒（坦布苏病毒的 一个基因型）通过库蚊传播，在马来西亚引起了以脑炎和生长迟缓为特征的鸡的传染 病。在我国引起蛋鸭产蛋下降及死亡的这种新兴坦布苏病毒与 Sitiawan 病毒致病性也 有很大不同，Sitiawan 病毒能引起鸡发病，但新发现的这种坦布苏病毒不能引起鸡发 病，但可以通过直接接触使鸭发病，并且在鸭群中快速传播，导致感染鸭出现病毒血 症和全身性病理损伤。通过序列分析发现鸭体内分离到的这种新兴病毒的 NS5 基因 核苷酸序列与坦布苏病毒 NS5 基因核苷酸序列同源性为 88%左右，氨基酸序列同源 性高达 98%，根据黄病毒属病毒的命名规则，将这种病毒命名为鸭坦布苏病毒[1]。1.1 病原学1.1.1 鸭坦布苏病毒的形态结构及理化特性在分类学上 DTMUV 属于黄病毒科的黄病毒属，是约 70 个黄病毒成员之一，DTMUV 具有典型的黄病毒形态，病毒粒子为球形，二十面体对称，有囊膜，毒粒直径为 37～ 50nm，外有脂质包膜，表面有棘突，电子显微镜观察可见核心、囊膜和囊膜突起等构 造[2～3]。在 CsCL 中的浮密度为 1.24～1.25g/cm3，沉降系数 200 s，其分子质量约为 3 000kD。DTMUV 能在动物、鸡胚及鸭胚成纤维细胞（DEF）、DF-1（鸡胚成纤维细胞