青藤碱干预肿瘤细胞凋亡的erk-bcl-2信号转导机制研究-erk - bcl - 2 signal transduction mechanism of sinomenine intervening tumor cell apoptosis.docxVIP

缩略词表SINSinomenine青藤碱ILInterleukin白介素TNFtumor necrosis factor肿瘤坏死因子NKNatural killer cell自然杀伤细胞COX-2Cycloxygenase-2环氧化酶 2PGEProstaglandin E前列腺素 EPKCProtein kinase C蛋白激酶 CMAPKmitogen-activated protein kinase丝裂原活化蛋白激酶TXA2Thromboxane A2血栓烷 A2 ERKExtracellular rugelated protein kinase细胞外信号调节激酶PMSFPhenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟 MTT3-(4,5-dimethylthiazal-2yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide四甲基偶氮唑盐DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜HRPHorseradish peroxidase辣根过氧化物酶LPSLipopolysaccharide脂多糖SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠声 明硕士学位论文青藤碱干预肿瘤细胞凋亡的 ERK-Bcl-2 信号转导机制研究是 本人在成都中医药大学攻读硕士学位期间在导师的指导下完成的，该论文的成果 归成都中医药大学所有。有关学位论文成果的开发、转让、发表等，均 需征得导 师和成都中医药大学同意。 硕士生签名： 导师签名： 前言青藤碱是防己科植物青藤及毛青藤的藤茎中提取的一种生物碱，有明确的化学结构(C19H23NO4，MW329.38)[1]。目前对青藤碱的药理作用研究主要集中在神经系统、心血管系统和免疫系统。现有的研究表明青藤碱对中枢神经系统有镇静、催眠、 镇痛以及一定程度的解热作用；对心血管系统有降压、抗心律失常和 保护心功能的作用；对免疫系统的作用包括抗炎和免疫抑制作用。抑 制炎症局部 PGE 的合成是其抗炎的机制之一[2]，青藤碱可能是通过选 择性抑制环氧化酶-2(COX-2)的活性，达到抑制 PGE2 的合成的目的。青藤碱的免疫抑制作用表现在可引起小鼠胸腺及脾脏重量减轻，对小 鼠抗羊红细胞抗体产生及对羊红细胞诱导的迟发超敏反应均有明显 的抑制作用。在体外，青藤碱对小鼠脾细胞的增殖反应也呈较强的抑 制作用。另外，青藤碱可通过抑制滑膜细胞增生、诱导滑膜细胞凋亡，诱 导脾淋巴细胞凋亡，从而减轻 RA 的免疫反应[3]。目前，青藤碱诱导 细胞凋亡作用的研究还局限在对凋亡细胞的细胞观察层面上，对其分 子机制还需进行深入研究。青藤碱主要用于风湿、类风湿性关节炎，肾小球肾炎等疾病的治 疗[4]。但目前尚未见有人对青藤碱抑制肿瘤的作用机制进行研究的报 道。同样作为免疫抑制剂，并能引起细胞凋亡的雷公藤甲素，已经有 人对其进行了诱导肿瘤细胞凋亡的研究，证明雷公藤甲素能抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡发生[5]。此次实验，我们希望通过初步青藤碱对体外培养 HeLa 细胞凋亡的影响，通过对细胞生长情况、细胞信号转 导通路蛋白和凋亡蛋白表达和细胞凋亡率的检测，初步探索青藤碱干 预信号转导通路与肿瘤细胞增殖凋亡的相关性。实验研究一 青藤碱对 HeLa 细胞增殖的影响1.1 实验材料 实验细胞HeLa 细胞 由四川大学华西医学中心免疫教研室提供实验药物盐酸青藤碱粉剂 成都句龙药业提供 纯度 99％批号 070819主要试剂MTTsigma 美国批号 0793 DMSO AMRESCO 美国 批号 0608RPMI1640 培养液Gybicol 美国 批号 0701新生牛血清 杭州四季青 中国 批号要仪器MLS-3020 全自动灭菌器日立 日本 MDF-U50V 超低温冰箱SAYON 日本 HEPA class100 细胞培养箱Thermo 美国 BP61S 电子天平Sartorius 瑞士D37520 低温离心机Kendro 美国25mm 细胞培养瓶 CORNING 美国96 孔板 COSTAR 美国Axudvdert25 倒置显微镜ZEISS 德国 MultiskanMK3 酶标仪Thermo 美国 超纯水机 Millipore 法国微量移液器 Finnpipette 芬兰1.2 实验条件 成都中医药大学病理形态实验室 成都中医药大学微生物与免疫学教研室1.3 实验方法 细胞培养细胞购回后，置于 25mm 培养瓶中，用含 10％新生牛血清的 RPMI1640 培养液培养，3 天后第一次传代，随后每 2 天换液，待细 胞覆盖 80％培养瓶底时，进行传代。待取得足够数量的细胞，即分 组给药观察。剂量设计本实验中青藤碱的给药量，青藤碱低、中、高剂