il31真核表达载体的构建及其对hacat细胞的影响-construction of il31 eukaryotic expression vector and its influence on ha cat cells.docx

英文缩略词表缩写IL英文全称Interlukin中文全称白细胞介素TNFTumorNecrosisFactor肿瘤坏死因子PMAPhorbolMyristateAcetate佛波酯CKCytokine细胞因子DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯BCABicinchoninicAcid二喹啉甲酸DMEMDulbeccosModifiedEaglesMedium改良的Eagles培养基EBEthidiumBromide溴乙锭ECLElectrochemiluminescence化学发光胞外信号调节激酶ERK1/2ExogenouslyRegulatedKinases1/21/2FBSFetalBovineSerum胎牛血清GAPDHGlyceraldehydePhosphateDehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶HaCaTThehumankeratinocytecellline人皮肤角质形成细胞ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验JAKJanusTyrosineKinase蛋白酪氨酸激酶LPSLipopolysaccharide脂多糖丝裂原激活的蛋白MAPKMitogen-ActivatedProteinKinase激酶mRNAMessengerRNA信使RNAMTT3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐-1-ODOpticalDelnsity光密度PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PI3KPhosphotidylinsitol-3-Kinase磷脂酰肌醇激酶PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PVDFPolyvinylideneFluoride聚偏氟乙烯Real-TimeReal-TimePolymeraseChainReaction实时PCRPCRRT-PCRReversedTranscriptivePolymeraseChain逆转录PCRReactionSDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SDSSodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳STATSignalTransducerandActivatorofTranscription信号转导子和转录激活子TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基二乙胺TrisMethyltris(methylethylketoxime)Silane三羟甲基氨基甲烷盐酸盐APAmmoniumPersulfate过硫酸铵UVBUltravioletLight,MidrangeSunbeam紫外线光谱SpectrumWBWestern-Blot免疫印迹COS-7AfricanGreenMonkeySV40-transfdkidneyfibroblastcellline非洲绿猴肾成纤维细胞PIPropidiumIodide碘化丙碇IL-31真核表达载体的构建及其对HaCaT细胞的影响中文摘要目的（1）克隆人白细胞介素-31（hIL-31）cDNA序列，构建pSecTag2/HygroB-IL-31真核表达载体。（2）将构建成功的pSecTag2/HygroB-IL-31真核表达载体转染COS-7细胞，筛选出稳定表达hIL-31的细胞株，分离并纯化hIL-31蛋白。（3）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，探讨其对IL-6、TNF-αmRNA和蛋白质水平表达的影响。（4）使用不同浓度的hIL-31作用于HaCaT细胞，探讨其对细胞周期和细胞增殖的影响。方法（1）采用淋巴细胞分离液分离获得人外周血单核细胞,培养之后加入终浓度为20nmol/L的PMA，继续培养24h后收集细胞。（2）Tizol法提取细胞总RNA，RT-PCR扩增hIL-31cDNA序列，并将其构建到真核表达载体pSecTag2/HygroB上。（3）使用DNA转染试剂盒将构建成功的pSecTag2/HygroB-IL-31转染至COS-7细胞当中，并使用潮霉素进行筛选，获得单个克隆后进行扩大培养，采用核酸蛋白检测仪进行蛋白质的分离与纯化。（4）使用不同浓度的hIL-31干预HaCaT细胞，采用Real-TimePCR的方法分析其对HaCaT细胞IL-6、TNF-αmRNA表达的影响；ELISA法检测其对HaCaT细胞IL-6、TNF-α蛋