igfbp4 5 7和胰岛素样蛋白在杂色鲍幼虫 附着变态过程中的作用研究-study on the role of igf bp 457 and insulin-like protein in the process of larvae adhesion and metamorphosis of abalone haliotis diversicolor.docx

I G F B P 4 5集 美 大 学 I G F B P 4 5 、 ， 和 胰 岛 素 样 蛋 白 在 杂 色 鲍 幼 虫 附 着 变 态 过 程 中 的 作 用 研 究 张 龙 辉 7IGFBP4 5 7 IGFBP4 5 7 万方数据 、 、 和胰岛素样蛋白在杂色鲍幼虫附着变态过程中的作用研究 张龙辉 万方数据 万方数据 学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人(签名)： 时 间： 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作 者(签名)： 导 师(签名)： 时 间： IGFBP4、5、7 和胰岛素样蛋白在杂色鲍幼虫 附着变态过程中的作用研究 摘 要 杂色鲍幼虫的附着变态过程，是其生活史中至关重要的时期。该时期的幼虫敏感而脆 弱，死亡率高，直接关系到其种群分布、数量变动。本研究在实验室构建的杂色鲍 EST 数 据库的基础上，采用 SMART-RACE 技术共成功克隆得到 3 条胰岛素超家族基因：胰岛素 样生长因子结合蛋白 4 (insulin-like growth binding protein 4，IGFBP4)、胰岛素样生长因子 结合蛋白 5 (insulin-like growth binding protein 5， IGFBP5) 和胰岛素样蛋白 (molluscan insulin-like peptide，MIRP) 基因的 cDNA, 分别命名为 hdIGFBP4、hdIGFBP5、hdMIRP。 连同实验室已克隆到的杂色鲍胰岛素样生长因子结合蛋白 7 (insulin-like growth binding protein 7， IGFBP7)(hdIGFBP7), 采用实时定量 PCR (qPCR)和基因沉默等技术分析上述基 因在杂色鲍幼虫附着变态过程中的作用。主要的研究结果如下： 1) hdIGFBP4 cDNA 全长为 584 bp，为无脊椎动物中首次克隆到 IGFBP4 基因的全长 cDNA，该基因序列编码 137 个氨基酸，包括一个 IB 结构域 (21-100 aa)。预测的氨基酸 序列中包含 CGCCXXC 保守基序，10 个高度保守的半胱氨酸残基。同脊椎动物 IGFBP4 相 比较，hdIGFBP4 缺少 C 端保守的 TY 结构域和中部特异的 L 区。对杂色鲍面盘晚期幼 虫进行 hdIGFBP4 RNAi 实验结果表明，干扰后的幼虫在 4 h 内，与空白对照组相比较， 死亡率显著升高 (P0.05) ，附着率显著降低(P0.05) ，而浮游率无显著变化(P0.05) 。 Real-time PCR 分析显示，干扰后 hdIGFBP4 mRNA 水平与空白对照组相比较，极显著下 调 (P0.01)，同时，hdIGFBP4 的相关通路 mRNA 表达水平也即显著下降(P0.01)。 2) hdIGFBP5 cDNA 全长为 921 bp，编码 136 个氨基酸，包括一个 IB 结构域 (42-121 aa)。预测的氨基酸序列中包含 CGCCXXC 保守基序，11 个高度保守的半胱氨酸残基。同 脊椎动物 IGFBP5 相比较，hdIGFBP5 缺少 C 端保守的 TY 结构域和中部特异的 L 区。 对杂色鲍面盘晚期幼虫进行 hdIGFBP5 RNAi 实验结果表明，干扰后的幼虫在 4 h 内，与 空白对照组相比较，死亡率极显著升高 (P0.01) ，附着率极显著降低(P0.01) ，而浮游 率无显著变化 (P0.05) 。Real-time PCR 分析显示，干扰后 hdIGFBP5 mRNA 水平与空白 对照组相比较，极显著下调 (P0.01)，同时，hdIGFBP5 的相关通路 mRNA 表达水平也即 显著下降(P0.01)。 3) hdIGFBP7 为实验室已获 cDNA 全长的基因。该基因 cDNA 全长为 1812 bp，编码 239 个氨基酸，包含 IB 结构域(22-88 aa) 、KI 结构域(89-128 aa) 和 IGc2 结构域(144-223 aa)。预测的氨基酸序列中包含 CGCCXXC 和 CGXDXXTYXN 2 个保守基序，18 个高度 I 保守的半胱氨酸残基。对杂色鲍面盘晚期幼虫进行 hdIGFBP7 RNAi 实验