igg型β1 6葡聚糖特异性抗体的制备及功能分析-preparation and functional analysis of igg β 16 glucan specific antibody.docx

第六章IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗的功能研究496.1Pustulan-BSA免疫效果的检测496.2IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗在体内具有抗肿瘤的作用506.3IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗具有抗真菌的作用516.4本章小结52第七章讨论557.1β-葡聚糖与蛋白质的偶联557.2IgG型β-1,6-葡聚糖单抗的制备567.3IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗的功能577.4总结59文献综述：多糖抗体的研究进展61参考文献75英文缩略词83致谢85个人简历87IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体的制备及功能研究硕士研究生：孙树良指导教师：高晓明教授苏州大学生物医学研究院（IBMS）免疫学系中文摘要作为一类在自然界中分布广泛且具有重要作用的物质，多糖的研究已有半个多世纪的历史，但因其分子结构复杂且庞大，同时缺乏有效的研究工具，使得多糖的相关研究发展缓慢。在多糖研究中，β-葡聚糖具有很重要的生理活性，一直以来都是人们关注的热点。它是由D-吡喃葡萄糖单体组成的多聚糖，广泛表达于真菌（如白色念珠菌、酵母菌、新生隐球菌、香菇和灵芝等）和植物（如燕麦、青稞等）中。白色念珠菌表面的β-葡聚糖以β-1,3-葡聚糖为主链，β-1,6-葡聚糖为侧链，这两种连接方式的葡聚糖均可作为模式识别分子（PAMPs）被机体免疫系统所识别，诱导机体产生免疫应答。已有研究证实IgG型β-1,3-葡聚糖特异性抗体具有很好的抗真菌感染能力，但IgM型的β-1,6-葡聚糖单抗则没有作用，因此，本课题首先制备了IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体，并探讨了其在抗真菌感染过程中的作用。我们首先将多糖与载体蛋白偶联来免疫小鼠而制备了IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗，通过流式细胞术和ELISA法确定该抗体能够很好地识别白色念珠菌表面的β-1,6-葡聚糖。进而，我们通过抗血清过继转移实验进一步研究了IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗在抗真菌感染中的作用。结果显示，IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗在体外可以较好的抑制真菌的生长，在体内明显的减少小鼠肾脏中真菌的载量。为进一步研究IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体的抗真菌感染作用，我们尝试制备IgG型β-1,6-葡聚糖单抗。我们通过化学方法将β-葡聚糖与载体蛋白相偶联，诱导机体产生IgG型β-1,6-葡聚糖特异性多抗，将免疫效果最好的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0在PEG1500作用下进行融合，通过杂交瘤技术筛选多糖特异性单克隆抗体，但多次融合筛选后均未得到IgG型β-1,6-葡聚糖单抗。此外，以IgG型β-1,6-葡聚糖抗体为工具，通过流式细胞术进一步检测发现EL-4细胞表面有β-1,6-葡聚糖表位的表达，该结果提示β-1,6-葡聚糖表位不仅是一种模式识别分子（PAMPs），同时可能也是一肿瘤相关糖抗原（TACAs）。为探究IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体是否具有抗肿瘤的作用，我们用β-1,6-葡聚糖-蛋白偶联物等不同抗原免疫C57BL/6小鼠，待小鼠体内有较高滴度的IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体后，皮下接种EL-4细胞，观察成瘤时间、测量瘤体大小并计算小鼠的生存时间。结果显示IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体可以在一定程度上减缓肿瘤的生长速度，延长小鼠的存活时间。总之，本课题的研究结果表明，β-1,6-葡聚糖不仅作为一种模式识别分子表达于白色念珠菌表面，同时也可作为一肿瘤相关糖抗原而表达于某些肿瘤细胞的表面。IgG型β-1,6-葡聚糖特异性抗体具有抗真菌感染和抗肿瘤的作用，这可能会为真菌感染和肿瘤的诊断与治疗提供新的途径。关键词：β-1,6-葡聚糖抗体；白色念珠菌；肿瘤；诊断；治疗ThegenerationandfunctionalstudyofIgGAbsspecificforβ-1,6-glucanMastersdegreecandidate:Shu-LiangSunSupervisor:Xiao-MingGaoInstitutesofBiologyandMedicalSciences(IBMS)ofSoochowUniversityAbstractPolysaccharidesarewidelypresentinnatureandtheirstructureandfunctionhavebeenstudiedoverseveraldecades.AsaclassofpolysaccharidescomposedofD-glucopyranosemonomer,β-glucaniswidelyexpressedonthecellwalloffungi(i.e.,Candidaalbicans,yeast,Cryptococcusneoformans,mushroomsa