il23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究-study on the role and mechanism of il23 in the development of hepatocellular carcinoma.docx

中文摘要IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究促进肝癌细胞维持在 S 期和 G2 期；划痕实验和 transwell 实验提示 IL-23 可以促进肝癌细胞的迁移。结论：体外实验揭示 IL-23 可以促进肝癌细胞的生长、增殖和迁移，并且可以 促进肝癌细胞维持在 S 期和 G2 期，但是不影响肝癌细胞的细胞凋亡。关键词： MTT 实验；Ki-67；细胞凋亡；细胞周期；迁移第三部分IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及机制的研究目的：利用小鼠肝癌动物模型探究 IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及其可能 的机制。方法：(1) 构建肝癌模型：(a.)取对数生长期的 hepa1-6 稳转细胞用 PBS 制成 单细胞悬液(5×105/ml)，每只小鼠注射的细胞量为 1×106/2 ml PBS，利用高压水流 动力学的注射方法在 5-8s 内将细胞通过尾静脉注射到小鼠体内。3 周后处死小鼠， 取出小鼠肝脏，计数肝脏肿瘤结节数； (b.) 提前一周给小鼠喝含抗生素 (80000U/250ml)的酸性水。取对数生长期的 hepa1-6 稳转细胞用 PBS 制成单细胞悬 液(4×107/ml)，每只小鼠注射的细胞量为 1×106/25 μl PBS，利用手术的方法，在超 净工作台中，将小鼠腹部剖开一小口，挤出肝脏一叶，用胰岛素注射器吸取细胞 缓慢的注射入暴露的肝脏中，再将小鼠伤口缝合。2 周后处死小鼠，取出小鼠肝脏， 测量并计算小鼠肿瘤体积；(c.) 取 14 天大的 C57BL/6 雄性小鼠，腹腔注射 DEN (25mg/kg)，于 SPF 级环境饲养 8-10 个月，从第 5 个月开始，每两个月采用高压水 流动力学的方法注射对照及 IL-23 微环质粒，8 个月后处死小鼠，计数肝脏肿瘤结 节数并测量肿瘤体积。(2) 通过流式染色检测荷瘤鼠及 HGT 注射 hepa1-6 稳转细胞后 1 周的非荷瘤 鼠脾脏和肝脏中淋巴细胞表面 CD3、CD4、CD8、CD62L、CD44、CD25、CD127、 CD11b、Gr1 等 marker 的阳性率；胞内染色检测荷瘤鼠及 HGT 注射 hepa1-6 稳转 细胞后 1 周的非荷瘤鼠脾脏和肝脏中 CD4+ T 淋巴细胞分泌的 IFN-γ、TNF-α 和 IL-17A 以及 CD8+ T 细胞分泌的 IFN-γ、TNF-α 和 IL-17A。利用 IL-17A 敲基因小 鼠重复 HGT 注射 hepa1-6 稳转细胞构建肝癌模型的实验确定 IL-17A 在 IL-23 介导 的促进肝细胞肝癌发展中的作用。采用 CBA 染色探究 IL-23 对外周血中细胞因子 的影响。IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究中文摘要结果：通过不同方法构建的肝癌模型表明 IL-23 在肝细胞肝癌发展中具有促进作用。流式染色结果表明在肝细胞肝癌发展后期 IL-23 影响了脾脏和肝脏中 MDSC、Treg 等抑制性细胞的所占的比例及 IFN-γ、TNF-α 和 IL-17A 的分泌。在 肝细胞肝癌发展早期流式染色结果表示 IL-23 影响了肝脏中 CD4+ 效应 T 细胞和 CD8+ 效应 T 细胞的比例以及脾脏和肝脏中 IL-17A 的表达水平，其中肝脏中分泌 IL-17A 的主要细胞是 NCR-ILC3 细胞。结论：IL-23 促进肝细胞肝癌的发展，其可能的机制为 IL-23 维持了 NCR-ILC3 细胞 IL-17A 的分泌进而影响了脾脏和肝脏中 MDSC、Treg 细胞的比例及 T 细胞分 泌的细胞因子，从而抑制了抗肿瘤免疫反应而促进了肿瘤的发展。关键词： 肝细胞肝癌；MDSC；IL-17A；NCR-ILC3作者：刘永浩 指导老师：刘海燕英文摘要IL-23 在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究The role of IL-23 in the development of hepatocellular carcinomaAbstractPart one Construction of murine single chain IL-23 expressing plasmid and its hepa1-6 IL-23-expressing cell line.Objective: To construct murine single chain IL-23 expressing plasmid and hepa1-6 IL-23-expressing cell line.Methods: The fragment of p19 and p40 were amplified by RT-PCR from the total RNA extracted from hepa1-6 cells. p19 and