igf1c结构域修饰的壳聚糖水凝胶增强脂肪干细胞治疗急性肾损伤的疗效-effect of igf1c domain modified chitosan hydrogel on enhancing adipocyte stem cells in the treatment of acute kidney injury.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于必威体育官网网址，在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：本研究使用胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的C结构域多肽修饰壳聚糖（CS）制备生物活性CS-IGF-1C水凝胶，评价水凝胶的细胞相容性及其对脂肪来源干细胞（ADSCs）体外增殖、抗凋亡和促血管生成等生物学特性的影响。建立小鼠急性肾脏损伤（AKI）模型，利用水凝胶负载ADSCs移植入受损肾脏，评价CS-IGF-1C能否改善ADSCs在体内存活并提高其多向分化能力，探讨其增强细胞治疗效果的机制，为使用组织工程学手段促进肾脏修复提供新的理论依据。方法：1.从表达绿色荧光蛋白（GFP）-萤火虫荧光素酶（Fluc）双融合蛋白的转基因小鼠脂肪分离ADSCs进行体外培养，评价细胞增殖能力，使用荧光显微镜、流式细胞学（FCM）及生物发光成像（BLI）证实细胞转基因特性，鉴定细胞表型并描述其多向分化潜能。2.合成IGF-1的C结构域（IGF-1C）多肽，并使用多肽修饰CS获得CS-IGF-1C，使用傅里叶红外光谱（FT-IR）分析CS-IGF-1C的化学结构、平行板流变仪检测水凝胶的流变学特性、扫描电镜（SEM）观察CS-IGF-1材料的形态，并评价CS-IGF-1C的成胶性能。在涂布水凝胶的培养皿中培养ADSCs，观察细胞形态并使用活死染色评价水凝胶的细胞相容性。3.将ADSCs培养于涂布水凝胶的培养皿中，使用CCK-8法和BLI评价细胞增殖能力，实时定量RT-PCR技术检测细胞中增殖相关基因（HGF、IGF-1和EGF）的表达。对ADSCs进行H2O2刺激诱导氧化损伤，使用BLI和AnnexinV/PI染色评价细胞凋亡，实时定量RT-PCR检测细胞中凋亡相关基因（Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl）的表达。此外，利用实时定量RT-PCR检测ADSCs血管新生基因（Ang-1/-2、VEGF-A、HIF-1α、PLGF、PDGF-BB、b-FGF和CCL5）的表达。4.构建FVB小鼠急性肾脏缺血损伤模型，根据治疗情况分组：sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C。利用BLI评价移植的ADSCs体内存活，高碘酸-希夫（PAS）染色及检测血清肌酐和尿素氮（BUN）的水平评价肾脏组织学和功能学恢复，损伤后14天使用GFP/Cytokeratin和GFP/CD31双染评价水凝胶对于ADSCs向肾小管上皮细胞和血管内皮细胞分化的影响。PCNA染色评价损伤后3天肾脏内细胞增殖及损伤后28天水凝胶注射部位和邻近区域细胞增殖情况。损伤后3天TUNEL和Bax染色评价肾脏内细胞凋亡。损伤后不同时间点CD31和α-SMA染色评价血管新生，损伤后14天CD31染色检测水凝胶注射部位毛细血管长入情况。对C57BL/6J背景VEGF-R2转基因小鼠诱导AKI，I分组为sham、PBS、CS、ADSCs、ADSCs/CS、ADSCs/CS-IGF-1C，损伤后BLI实时检测VEGF-R2表达，探讨血管新生的机制。损伤后2个月Masson、天狼星红及IV型胶原染色评价胶原沉积，α-SMA染色评价肌成纤维细胞浸润，利用免疫染色评价肾脏中MMP-2的表达。使用实时定量RT-PCR检测肾脏组织中促纤维化基因（TGF-β、Col1A1和α-SMA）的表达。结果：1.体外培养的ADSCs具有较强的增殖能力并稳定表达GFP，体外BLI分析显示细胞数量和生物发光强度存在正相关（R2=0.99）。ADSCs表达间充质干细胞表面标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105），不表达造血系细胞标记物（CD31、CD34、CD45），且能被诱导向脂肪、骨和软骨细胞分化。2.FT-IR分析证实IGF-1C多肽成功连接到CS上，流变学检测显示CS和CS-IGF-1C两种水凝胶的成胶温度为35°C-36°C，SEM结果显示两种材料均具有均一的相互联通的多孔结构，孔径约为50μm-100μm。此外，水凝胶具有良好的细