il21信号通路在血吸虫肉芽肿形成和发展中的调节作用-regulatory role of il21 signaling pathway in the formation and development of schistosome granuloma.docx

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2018-05-29 发布于上海
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il21信号通路在血吸虫肉芽肿形成和发展中的调节作用-regulatory role of il21 signaling pathway in the formation and development of schistosome granuloma

英文缩写英文缩写英文全称中文名称BpAmpdNTPDMSOEBIL-21IL-21RIPTGITsLBFBSODPAGEPBSPCRRIPsbasepairampicillinDeoxynucleotidetriphosphatesdimethylsulphosideethidiumbromideInterleukin-2Interleukin-21receptorIsopropy1-thio-β-D-galactosideImmunotoxinsLuriabrothFetalcalfserumOpticaldensityPolyacrylamidegelelectrophoresisPhosphate-buffered-salinePolymerasechainreaction碱基对氨苄青霉素脱氧三磷酸核苷二甲基亚砜溴化乙锭白介素-21白介素2受体异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷免疫毒素LB培养基胎牛血清光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液多聚酶链反应核糖体灭活蛋白RPMRibosomeinactivatingproteinsRotationperminute每分钟转速SDSTrisSodiumdodecylsulfateEtihylaminomethane十二烷基硫酸钠三羟甲基氨基甲烷IL-21信号通路在血吸虫肉芽肿形成和发展中的调节作用中文摘要目的：构建、诱导表达重组免疫毒素mIL-21-LuffinP1，体外验证其生物活性和靶向性。通过小鼠日本血吸虫感染模型，观察重组免疫毒素mIL-21-LuffinP1对肝脏虫卵肉芽肿形成的抑制作用并研究其可能的作用机制，进一步搜寻和鉴定IL-21/Th17信号通路在血吸虫肉芽肿形成和发展中的作用。方法：采用基因工程技术将重组基因片段mIL-21-LuffinP1克隆入表达载体Pet32a（+）中，经酶切和DNA序列测定正确后，转化至表达宿主菌BL21中，经IPTG诱导表达mIL-21-LuffinP1融合蛋白。通过MTT和流式细胞术，体外检测重组毒素mIL-21-LuffinP1的细胞毒性和靶向性。通过小鼠日本血吸虫感染模型，病理学分析mIL-21-LuffinP1对肝脏虫卵肉芽肿形成的抑制作用，实时荧光定量PCR法检测小鼠肝脏中Th17相关细胞因子IL-17、转录因子ROR-γt和炎症趋化因子CXCL1、CXCL2mRNA表达水平。结果：成功构建重组免疫毒素表达载体Pet32a（+）-mIL-21-LuffinP1，并诱导蛋白表达。MTT法显示mIL-21-LuffinP1能够明显抑制表面高表达IL-21R的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的增殖，其抑制效应呈浓度依赖性增强，流式双染SP2/0细胞表面标记IL-21R和AnnenixV，显示mIL-21-LuffinP1可以针对表面表达IL-21R细胞诱导细胞凋亡，即具有靶向性。以小鼠日本血吸虫感染模型，感染第四周开始尾静脉注射mIL-21-LuffinP1或LuffinP1，感染6周后剖杀小鼠，通过肝脏切片HE染色和肉芽肿面积统计分析，显示mIL-21-LuffinP1具有体内抑制肉芽肿病变的作用（P＜0.05），而注射LuffinP1组小鼠肝脏肉芽肿病变程度与空白对照组相比无明显差异（P＞0.05）。与空白对照组相比，虽然mIL-21-LuffinP1组小鼠肝脏炎症趋化因子CXCL1、CXCL2mRNA水平无明显差异（P＞0.05），但炎性细胞因子IL-17mRNA水平明显降低（P＜0.05）。值得注意地是，mIL-21-LuffinP1组小鼠肝脏中Th17上游转录因子ROR-γtmRNA水平并没有出现预期的降低趋势，相反，其mRNA水平总体呈上升趋势，且具有统计学差异（P＜0.05）。结论：成功构建并表达纯化出重组免疫毒素mIL-21-LuffinP1，并验证其具有细胞毒性和靶向性；小鼠实验结果表明，重组免疫毒素mIL-21-LuffinP1可以明显抑制感染日本血吸虫小鼠肝脏肉芽肿的形成，其作用机制有可能是通过重组免疫毒素mIL-21-LuffinP1的靶向杀伤Th17细胞作用来阻断IL-21信号通路从而抑制Th17下游效应分子IL-17A水平，最终抑制肉芽肿炎症反应。关键词：免疫毒素；白介素-21；骨髓瘤细胞；细胞凋亡；日本血吸虫，Th17细胞TheroleofIL-21signalingpathwaysinschistosomiasisgranulomaformationanddevelopmentAbstractObjective：ToconstructandexpressrecombinantimmunotoxinofmIL-21-LuffinP1，anddeterminethebiologicalactivityinvitr