ido1和ido2在胆囊癌细胞免疫耐受形成中的作用机制分析-analysis of the mechanism of i do 1 and i do 2 in the formation of cellular immune tolerance in gallbladder carcinoma.docx

原发性胆囊癌；吲哚胺 2，3 双加氧酶 1；叉状头转录因子 3 论文二 IDO1 和 IDO2 在胆囊癌细胞免疫耐受形成 中的作用机制研究 IDO1 是一种细胞内含亚铁血红素的酶通过催化氧化裂解色氨酸分子中的吲 哚环, 从而使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢。IDO1 在肿瘤免疫逃逸中起到重要 作用，因此, 目前认为 IDO1 的高表达是导致机体对肿瘤产生免疫耐受的重要因 素之一。最近研究发现, 有一种在编码基因序列、分子结构及生物活性上与 IDO1 十分相似的物质，它被命名为 IDO2，发现抑制 IDO2 比抑制 IDO1 在抑制肿瘤生 长方面更有效果。推测其在免疫耐受中也起到重要作用。因 IDO2 为近几年才发 现的色氨酸分解酶，所以前期研究的 IDO 现在被称为 IDO1. 目的 探讨 IDO1、IDO2 在胆囊癌细胞株 SGC-996 中的表达及在免疫耐受形成中的作用 方法 1. 用免疫印记法及免疫荧光检测不同浓度 IFN-γ刺激人胆囊癌细胞 SCG-996 后 IDO1、IDO2 的表达情况； 2. 用 RNA 干扰分别沉默胆囊癌细胞株 SGC-996 中 IDO1、IDO2 蛋白的表达，用免 疫印记法检测沉默效果； 3. 高效液相色谱法（HPLC）检测分别干扰 IDO1、IDO2 后培养基中犬尿酸的变化， 进而评估 IDO 酶活性的变化。 4. 用人外周血淋巴细胞与 SGC-996 分别干扰 IDO1、IDO2 培养基共培养 24h 后， 收集外周血淋巴细胞，Annexin V/PI 双标记检测人外周血淋巴细胞凋亡。 结果 1. Western blot 检测结果显示，随着 IFN-γ加入浓度由低到高，胆囊癌细胞株 SGC-996 中 IDO1 表达与 IFN-γ成剂量依赖的关系；在无 IFN-γ刺激下无表 达，随着 IFN-γ浓度的增加表达也增多。IDO2 无论在有无 IFN-γ，或 IFN- γ浓度高低，呈都恒定表达。 2. 共聚焦显微镜在检测 IDO1 时，无 IFN-γ时，IDO1 含量很低，在有 IFN-γ 刺激时，IDO1 表达增加，IDO1 定位于细胞浆中。而 IDO2 却恒定表达，不 受 IFN-γ的影响，定位于胞浆和细胞核内。 3. HPLC 发现无 IFN-γ刺激和沉默 IDO1 时，培养基中犬尿氨酸浓度几乎为零， 而在沉默 IDO2、CTL、Mock 组中犬尿酸的浓度明显增加。沉默 IDO1 组和 沉默 IDO2、CTL、Mock 组之间差异有统计学意义（p＜0.01），表明 IDO1 和 IDO2 同时在 IDO 酶催化色氨酸分解为犬尿氨酸的过程中，IDO1 起主要作 用。 4. 流式细胞仪分析不同的条件培养基与人外周血淋巴细胞培养 1 天后，在阴性 组、IDO1 沉默组、IDO2 沉默组死亡率分别为 0.8%、1.1%、1.9%，而在阳性 对照组中晚期凋亡及死亡细胞增多，分别为 15.4%、12.4%、13.6%。IDO1 沉默组、IDO2 沉默组与阳性对照组差异有统计学意义。 结论： IDO1 在 IDO 酶催化活性中起主要作用，抑制胆囊癌细胞中 IDO1 或 IDO2 的活性 可减少淋巴细胞死亡，为研究 IDO1、IDO2 在免疫耐受形成中的作用提供依据。 【关键词】原发性胆囊癌；吲哚胺 2，3 双加氧酶 1；吲哚胺 2，3 双加氧酶 2 Studying on the expression of IDO1、IDO2 in gallbladder carcinoma cells and the role of immune tolerance Name: GaoJian Supervisor： Prof.JiaoXing-yuan Prof.Peng He-ping Abstract Primary carcinoma of the gallbladder (PCG) is a common malignant tumors of the biliary system, ranking fifth to sixth of digestive tract tumors.PCG patients often concealed with gallbladder stones and other diseases, early diagnosis rate was only 9.1%.It`s often at advanced stage when diagnosised, losting opportunity to surgery. With the rapid development of tumor molecular biology and tumor immunology, and