ho1基因修饰的bmmscs对减体积移植肝保护作用的研究-protective effect of ho1 gene modified bmm scs on liver transplantation with reduced volume.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于必威体育官网网址，在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要研究目的：通过建立大鼠50%减体积肝移植排斥模型，检测载有血红素加氧酶-1（HO-1）基因的重组腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞（BMMSCs）形成的HO-1/MSCs对减体积肝移植排斥模型受体的保护作用，同时探讨其可能机制。研究方法：（1）BMMSCs的体外培养及扩增采用密度梯度离心联合贴壁筛选法，在倒置显微镜下观察其形态，流式细胞术鉴定其表型，染色法检测其转化为脂肪和成骨细胞的能力。将载有HO-1基因的重组腺病毒载体感染至BMMSCs，构建HO-l/MSCs，荧光显微镜观察其转染率。（2）建立稳定的大鼠原位、50%减体积、30%减体积肝移植排斥模型，观察各组术后1、3、7和14d存活率,分析死亡原因。检测外周血清中的ALT、AST及TBIL水平；光镜观察移植肝脏组织病理学改变和排斥反应分级。（3）冰切片技术检测HO-l/MSCs在肝脏内分布情况；将50%减体积肝移植排斥模型分4组：①生理盐水处理组（NS组）；②HO-1组；③BMMSCs组；④HO-l/MSCs组。观察受体术后临床表现、存活时间，计算存活率率；测肝重，计算肝再生速率；免疫组化染色观察增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平，计算PCNA指数；ELISA法测外周血清肝细胞生长因子（HGF）水平。（4）模型和分组同前，检测外周血清中的ALT、AST及TBIL水平；光镜观察移植肝脏组织病理学改变和排斥反应分级；透射电镜下观察移植肝脏组织的超微结构改变；ELISA法检测各组大鼠在各时间点外周血清IL-10、TGF-β、IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α的水平；流式细胞术测定外周血清调节性T细胞（Treg）水平。研究结果：（1）细胞贴壁生长成熟后，主要为长梭形，部分可以为漩涡或菊花状排列，具备BMMSCs典型形态特征。流式细胞术鉴定细胞表面抗原结果显示：CD29、CD90和RT1A阳性率分别为97.50%、93.30%和96.70%，CD34、CD45和RT1B阴性率均99%。染色法结果显示：油红O染色示胞浆内出现红色脂滴，VonKossa染色示细胞中出现黑色钙盐。构建HO-l/MSCs48h后，细胞绿色荧光阳性表达率大约85%。（2）观察受体鼠存活率及肝体积结果：原位组1、3、7和14d存活率分别为91.20%、86.50%、81.10%和75.70%；50%减体积组移植肝占全肝百分比为：(49.30士1.43)%，1、3、7和14d存活率分别为85.00%、80.00%、62.50%和45.50%；30%减体积组移植肝占全肝百分比为(31.20士1.74)%，1、3、7和14d存活率分别为65.00%、50.00%、35.00%和17.50%。30%减体积组1、3、7和14d存活率与原位组及50%减体积组分别相I比，都降低，存在统计学差异（P0.05）。外周肝功能（ALT、AST及TBIL）水平：30%减体积组分别与原位及50%减体积组相比较，都降低，存在统计学差异（P0.05）。各组术后7d病理均显示存在中到重度排斥反应。（3）HO-l/MSCs在肝脏内分布、受体大鼠存活率及肝再生情况：冰切片显示HO-l/MSCs在移植肝脏内分布密集。NS、HO-l、BMMSCs和HO-l/MSCs组受体大鼠的中位生存时间分别为13、15、25和38d；HO-l/MSCs组与其他三组相比，存活率提高，均存在统计学差异（P0.05）；BMMSCs组与NS、HO-l组相比，存活率提高，均存在统计学差异（P0.05）。HO-l/MSCs组与其他三组相比，术后3、5、7和14d肝再生速率、PCNA指数以及外周血清HGF水平均升高，存在统计学差异（P0.05）；BMMSCs组与NS、HO-l组相比，同样升高，存在统计学差异（P0.05）。（4）观察HO-l/MSCs对50%减体积肝移植排斥模型的免疫调节作用：①本部分各组术后受体一般情况及存活率比较结果同第三部分。②肝功能的结果：各组ALT