hnrnp a2b1及mcl1在乳腺癌细胞中的表达水平及意义-expression level and significance of hn rnp a2 b1 and mcl 1 in breast cancer cells.docx

现[9]。Mcl-1可与其他蛋白相互作用,调节细胞的凋亡；Mcl-1能结合Bcl-2家族促凋亡蛋白(Bim,Bak)，并维持其在线粒体膜表面的活性,阻止它在线粒体膜上形成二聚体,抑制了线粒体中细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡；Mcl-1也可直接对细胞分化和细胞周期进行调控。Mcl-1在细胞的生长和分化过程中是一个必要的抗凋亡因子，调节其表达的信号传导通路中的任何一个环节出现调节紊乱都会引起Mcl-1的过度表达，从而诱导细胞抵抗凋亡能力增强，导致包括肿瘤在内的人类一些疾病的发生。已有研究表明，Mcl-1蛋白表达下调可促进肿瘤细胞的凋亡，提示Mcl-1是人类多种肿瘤的潜在治疗靶点，因此研究Mcl-1基因在不同肿瘤组织及细胞系中的异常表达对了解肿瘤发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义[10，11]。然而，Mcl-1是否在乳腺癌中表达，表达水平是否与hnRNPA2/B1的表达相关，目前仍不清楚。基于上述分析，我们拟在乳腺癌组织标本中，通过免疫组化方法，检测hnRNPA2/B1及Mcl-1在乳腺癌组织中的表达，并分析它们与乳腺癌侵袭转移病理参数之间的关系，包括乳腺癌TNM分期、是否发生转移、肿瘤直径、人表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2Her-2)表达水平，年龄、激素受体、分化程度等，并对hnRNPA2/B1及Mcl-1表达水平进行相关性分析；同时我们体外培养乳腺癌细胞MCF-7，通过转染hnRNPA2/B1siRNA，检测转染前后乳腺癌细胞的凋亡情况，初步探讨hnRNPA2/B1表达水平与乳腺癌细胞凋亡之间的关系。通过本研究，以期探索hnRNPA2/B1及Mcl-1表达水平是否与乳腺癌发生及转移有关，hnRNPA2/B1是否与乳腺癌细胞凋亡有关，有助于丰富对乳腺癌发生、转移分子机制的认识，并为寻找干预乳腺癌侵袭转移的靶点提供理论支持，最终将有助于改善乳腺癌患者的预后。材料与方法1实验材料1.1研究对象1.1.1实验分组实验组：女性，40例，选自贵阳市妇幼保健院2005年1月至2009年1间乳腺癌患者，其中25例发生转移(包括淋巴转移及远处转移),15例未发生转移；对照组：女性，20例，选自贵阳市妇幼保健院2005年1月至2009年1月间乳腺纤维瘤患者。全部病例诊断在术中或术后均经病理学证实，所有乳腺癌病例术前均未接受任何放射治疗或化学疗法。肿瘤组织取出后10分钟内放入福尔马林固定后，做成石蜡切片。1.1.2所有患者均记录年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度、乳腺癌TNM分期、是否发生转移、Her-2表达水平，激素受体情况。肿瘤分期根据AJCC(2002，第6版)的乳腺癌TNM分期方法。具体资料见表格1.表1乳腺癌患者一般资料Tab.1TheGeneralInformationofBreastCancerPatients临床参数例数年龄≤35岁5＞35岁35TNM分期T19T219T38T44肿瘤直径≤2cm9＞2cm31是否转移否15是25肿瘤分化高16中13低11受体情况ERPR(+)22ERPR(-)18Her-2-2+17++17+++41.1.3MCF-7乳腺癌细胞株购买于购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养条件如下：培养液：高糖DMEM＋10％特级胎牛血清；消化液：0.25％胰酶＋0.02％EDTA冻存液：二甲亚砜培养液1:9传代时间：3－4天，传代时尽量将细胞吹打成单细胞悬液1.2主要试剂及耗材名称生产厂商hnRNPA2∕B1siRNA武汉市晶赛生物工程技术有限公司鼠抗人hnRNPA2/B1单克隆抗体美国Sigma公司兔抗人Mcl-1多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司SP-9002小鼠免疫组化试剂盒北京中杉金桥SP-9005兔免疫组化试剂盒北京中杉金桥0.01MPBS北京市中杉金桥生物技术有限公司浓缩型DAB试剂盒北京中杉金桥DMEM培养基、特级胎牛血清美国Gibico公司ProteinA/GPLUSAgarose美国SantaCruz公司complete，Mini，EDTA-Free蛋白酶抑制剂美国Roche公司MTT比色法细胞繁殖定量试剂盒美国Genmed公司Matrigel美国BDBiosciences公司Fibronectin美国BDBiosciences公司TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒武汉博士德生物工程有限公司0.2mL、1.5mL、4.5mL离心管德国Eppendorf公司各种型号移液器枪头德国Eppendorf公司15mL、50mL离心管美国Falcon公司25cm2、75cm2、175cm2培养瓶美国Falcon公司15mL、50ml离心管美国Falcon公司放射自显影胶片重庆金麦生物科技有限公司放射自显影片盒重庆金麦生物科技有限公司