hmgb1a box对sw480和thp1细胞lpstlr4信号通路的影响-effects of hmgb 1a box on lpst lr 4 signaling pathway in sw 480 and th p1 cells.docx

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2018-05-29 发布于上海
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hmgb1a box对sw480和thp1细胞lpstlr4信号通路的影响-effects of hmgb 1a box on lpst lr 4 signaling pathway in sw 480 and th p1 cells.docx

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hmgb1a box对sw480和thp1细胞lpstlr4信号通路的影响-effects of hmgb 1a box on lpst lr 4 signaling pathway in sw 480 and th p1 cells

摘要目的：观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中LPS/TLR4的影响，为以HMGB1-Abox为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法：㈠LPS对SW480细胞HMGB1表达的影响实验分组如下：①对照组：SW480+0ng/mlLPS；②实验组1：SW480+100ng/mlLPS；③实验组2：SW480+1000ng/mlLPS；④实验组3：SW480+10000ng/mlLPS；培养SW480细胞至对数生长期，给予不同浓度LPS分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB1的表达(重复3次)。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达细胞株⑴HMGB1-Abox重组真核质粒的构建及鉴定①在GeneBank中查找人HMGB1-Abox基因序列，由公司基因合成。②将合成的HMGB1-Abox基因插入到pEGFP-N1载体，构建重组质粒。扩增及提取重组质粒，鉴定方法采用酶切和测序。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达采用阳脂质体转染技术将pEGFP-N1-HMGB1-Abox转染SW480细胞，分别观察有无绿色荧光及荧光强度，并收集细胞检测HMGB1-AboxmRNA表达水平(重复3次)。㈢HMGB1-Abox高表达和EP对SW480肠上皮细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子的影响实验分组：①对照组：SW480细胞；②EP组：SW480细胞+EP；II③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞；④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞上述各组再分为LPS及无LPS处理。（EP为5mM，预处理1h，LPS为1000ng/ml，24h)，24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈣EP及HMGB1-Abox高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响用Transwell系统将SW480细胞和THP-1细胞共培养，实验分组：①对照组：SW480细胞+THP-1；②EP组：SW480细胞+EP+THP-1；③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞+THP-1；④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞+THP-1上述各组再分为LPS处理及无LPS处理。（EP为5mM，预处理1h，LPS为1000ng/ml，24h)，24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈤检测方法：①实时荧光定量PCR方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88mRNA表达。②免疫印迹方法检测细胞HMGB1、TLR4、MyD88、pNF-κBp65蛋白表达。③双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中HMGB1含量。④固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果：㈠LPS对SW480细胞内HMGB1的影响：①不同浓度的LPS处理SW480细胞12h，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中LPS浓度为100ng/ml组与对照组相比，有统计学差异(P0.05)；不同浓度LPS处理24h时，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中1000ng/ml组HMGB1mRNA表达与对照组相比，有统计学差异(P0.01)，而其它组间HMGB1mRNA表达无统计学差异(P0.05)。②LPS处理SW480细胞不同时间，24h组HMGB1mRNA表达均高于12h组，但只有1000ng/ml组有统计学意义(P0.05)，故本实验选用LPS的处理时间为24h，作用浓度为1000ng/ml。III㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达SW480细胞⑴HMGB1-Abox重组真核表达质粒的构建及鉴定成功构建pEGFP-N1-HMGB1-Abox重组表达质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳显示两条带，其分子量大小与预期大小相同。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库(GenBankAccession:NM_002128.4)中的HMGB1-Abox基因序列相似性为100%。⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达HMGB1-Abox重组质粒转染SW480细胞后，在荧光显微镜下出现绿色荧光。细胞内HMGB1-AboxmRNA表达高于未转染组(P0.01)，提示转染成功。㈢EP和HMGB1-Abox高表达对SW480细胞HMGB1、LPS/TLR4信号通路及促炎因子分泌的影响⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达：HMGB1mRNA和蛋白的表达在无LPS处理组之间无统计学差异（P0.05）,在LPS处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组（P0.05），后3组之间无统计差异（P0.05）；除EP组，各LPS处理均显著高于相对应的