hlaa0206bsp和a0207bsp融合基因的构建与表达-construction and expression of hlaa 0206 bsp and a0207 bsp fusion gene.docx

HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的构建与表达研究生朱丽君导师吴雄文教授华中科技大学同济医学院免疫学系中文摘要背景：主要组织相容性分子（MHC）在免疫应答中起着十分重要的作用，其主要生物学功能是将抗原肽提呈给T细胞识别。MHC分子具有高度的多态性，多态性的氨基酸残基常位于抗原肽结合槽，使MHC分子的型别影响对抗原肽的结合和提呈，从而影响T细胞应答。HLA-A2为最常见的HLAI类分子型别，HLA-A2阳性个体约占我国人群的50%。包括多达99种亚型，其中HLA-A*0201，-A*0206，-A*0207三个亚型的基因频率最高[1,2]，分析占人群中大多数的HLA-A*02亚型分子识别的抗原肽谱、亲合力及其诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)反应能力具有十分广泛的实际意义，近年来来自国外的临床移植病例观察资料也提示供受者间HLA-A2亚型相配能显著提高造血干细胞移植后受者的存活率和移植效果[3]。目的与方法：为了克隆HLA-A*0206和-A*0207全长cDNA序列，构建并表达HLA-A*0206和-A*0207的?链（重链）胞外区与BirA酶底物肽（BirAsubstratepeptide,BSP）的融合蛋白。本研究先采用RT-PCR技术从HLA-A*0206和-A*0207阳性个体的外周血PBMC中分别克隆出HLA-A*0206和-A*0207基因的全长cDNA序列，构建HLA-A*0206和-A*0207克隆载体。再利用PCR技术从构建的克隆载体中扩增HLA-A*0206和-A*0207的?链（重链）胞外段序列,分别经双酶切置换本室保存的HLA-A*0201-BSP重组体中的HLA-A*0201胞外段序列，使HLA-A*0206和-A*0207与BirA酶底物肽（BirAsubstratepeptide,BSP）序列融合，构建HLA-A*0206和-A*0207-BSP融合基因的表达载体。然后将该表达载体转化E.coliBL21(DE3)后获得表达产物，通过体外稀释复性，初步纯化的表达产物通过ELISA和WESTERN-BLOT检测。以期为进一步构建HLA-A*0206和-A*0207四聚体或包被在微球上制成人工抗原提呈细胞，探讨相应HLA-A2亚型的功能特点提供了物质基础。结果：成功的扩增出HLA-A*0206和-A*0207重链的全长cDNA序列及其胞外段序列，构建了HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的表达载体，并经限制性酶切、PCR鉴定和DNA测序证实；该表达载体转化E.coliBL21(DE3)后获得表达产物，通过体外稀释复性，初步纯化的表达产物能够与?2微球蛋白（HLAI类分子轻链）及HLA-A2限制性抗原肽（HBVcore18-27）折叠形成具有HLAI类分子天然构像的抗原肽/HLA-A2复合物单体。结论：本研究在克隆HLA-A*0206和-A*0207重链全长cDNA的基础上，构建了HLA-A*0206-BSP和-A*0207-BSP融合基因的表达载体，为进一步构建HLA-A*0206和-A*0207四聚体，探讨相应HLA-A2亚型的功能特点提供了物质基础。关键词：克隆；HLA-A*0206和-A*0207；生物素化序列constructionandexpressionofHLA-A*0206-BSPand-A*0207-BSPPostgraduate:ZhuLijunTutor:WuXiongwenInstituteofImmunology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnologyAbstractBackground:MHCmoleculesplayanimportantroleintheimmunesystem,itsmayorfunctionistobindpeptidefragmentsderivedfrompathogensanddisplaythemonthecellsurfaceforrecognitionbytheappropriateTcells.TheMHCishighlypolymorphic,thevariantaminoacidsaremostlylocatedinthepeptidebindinggroove,thepeptides’bindingaffinitycoulddirectlyaffectitspresentationbyHLAmolecules,andthereforeitscapacitytoactivateTcells.HLA-A2isthemostfrequenttypeofHLAclas