hivtat ptd结构域介导的sod1转导对放射性皮肤损伤的治疗作用及机制分析-therapeutic effect and mechanism analysis of hiv tat ptd domain-mediated so d1 transduction on radiation-induced skin injury.docx

中文摘要第一部分：TAT-SOD1原核表达载体的构建及重组蛋白的表达纯化目的：超氧化物歧化酶SOD由于具有催化超氧阴离子自由基降解为氧气和过氧化氢的功能，广泛应用于临床常用的皮肤射线防护喷剂中。但普通的SOD1蛋白一方面由于来源于动物血液，存在安全性隐患，另一方面由于分子量大，无法跨越细胞膜进入细胞内，限制了其应用。本研究拟在大肠杆菌中表达融合了蛋白转导结构域（PTD）HIV-TAT及人铜锌超氧化物歧化酶（Gu/ZnSOD,SOD1）的重组蛋白（TAT-SOD1），纯化上述蛋白后验证其蛋白转导作用及入胞后的生物学作用。方法：合成HIV-TAT结构域的编码序列(YGRKKRRQRRR)及利用聚合酶链反应（PCR）扩增人SOD1编码序列后，插入到原核表达载体pET-28a，由此产生了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体。我们同时构建了不含TAT结构域的pET-28a-SOD1原核表达载体。利用宿主大肠杆菌BL21（DE3）表达重组蛋白，超声破碎细胞后，利用镍-琼脂糖凝胶层析柱纯化后得到了重组TAT-SOD1蛋白。利用免疫荧光试验、SOD酶活试验，超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验验证重组TAT-SOD1蛋白的跨膜作用及跨膜后的生物学活性。结果：成功构建了pET-28a-TAT-SOD1原核表达载体，导入大肠杆菌后，通过诱导表达纯化，得到了高纯度重组TAT-SOD1蛋白。免疫荧光结果显示重组蛋白能够跨细胞膜进入细胞。SOD酶活试验，超氧阴离子清除试验及总抗氧化能力测定试验结果示，入胞后的重组蛋白仍然保留生物学活性。结论：通过将原核表达载体pET-28a-TAT-SOD1导入大肠杆菌，表达及纯化得到重组TAT-SOD1蛋白，验证了其跨膜作用及跨膜后的生物学活性。关键词：铜锌超氧化物歧化酶，蛋白转导结构域，HIV-TAT结构域，原核表达第二部分：重组TAT-SOD1蛋白对皮肤细胞电离辐射损伤防护作用及机制研究目的：研究TAT-SOD1对比普通SOD1对人皮肤HaCaT细胞辐射损伤的防护作用及机制，进一步在动物模型上验证TAT-SOD1的辐射保护作用及其机制。方法：CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化；AnnexinV-PI双染及WesternBlot检测凋亡相关蛋白用于检测电离辐射所致细胞凋亡；DCFH2-DA实验检测细胞内电离辐射诱导的自由基；Mito-Tracker线粒体染色实验检测电离辐射所致线粒体损伤；γH2AX免疫荧光检测DNA双链断裂（DSB）。建立放射性皮肤损伤的SD大鼠模型丙二醛（MDA）及DCFH2-DA用于检测SD大鼠电离辐射损伤后皮肤脂质过氧化及皮肤组织自由基水平。结果：在20GyX射线照射后，对比PBS组与普通SOD1组，TAT-SOD1组皮肤HaCaT细胞增殖能力损伤减轻。流式细胞仪分析TAT-SOD1组HaCaT细胞凋亡明显减少；WesternBlot表明凋亡相关蛋白Caspase-3，Bax表达明显减少、抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，提示重组TAT-SOD1蛋白可以明显减轻电离辐射所致皮肤细胞HaCaT的凋亡。TAT-SOD1可以明显减轻X射线所致细胞内明显增加的自由基水平和线粒体损伤。5GyX射线照射后，TAT-SOD1组DNA双链断裂的数目明显减少，双链断裂的修复较PBS及普通SOD1组快。动物实验表明，45Gy电子线照射后，SD大鼠皮肤组织的脂质过氧化及自由基水平均明显升高，而TAT-SOD1可以明显抑制电离辐射所致脂质过氧化及活性氧水平。结论：TAT-SOD1能够明显减轻电离辐射所致HaCaT细胞损伤，并且能够减少SD大鼠电离辐射照射后皮肤组织的活性氧及脂质过氧化水平，为放射性皮肤损伤的救治提供了新的治疗策略。关键词：电离辐射诱导皮肤损伤，细胞增殖能力，细胞凋亡，自由基，线粒体损伤，DNA双链断裂，脂质过氧化作者：谷庆指导教师：曹建平HIV-TATmediatedproteintransductionofCu/Zn-superoxidedismutase-1(SOD1)protectsskincellsfromionizingradiationPartⅠAbstractConstructionofTAT-SOD1prokaryoticexpressionvector,expressionandpurificationofrecombinantTAT-SOD1proteinObjectives:Thecommonlyusedskinprotectivespraysagainstionizingradiationconsistsofsuperoxidedismutase(SOD),whichcancatalyzethedismutationofsuperoxide(O2·?)intooxy