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生物分离工程 10 蛋白质复性 学习目的和要求 学习目的和要求 识记：包含体的概念 理解：包含体的形成过程、性质，包含体的体内抑制 以包含体形式表达的蛋白质，需要在回收后溶解，使其肽链伸展（unfolding)，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性。 这一过程称为蛋白质的体外再折叠（refolding）或复性（renaturation）。 难于复性的蛋白质，包含体的形成意味着表达系统的失败，必须研究胞内可溶性蛋白质的表达，避免包含体的形成； 可以体外复性的包含体蛋白质，蛋白质包含体的形成可以使后续的分离纯化过程变更简单，但蛋白质复性较困难。 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 10.1 包含体的形成和复性 3、包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化； 4、沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解； 5、对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达是最可取的生产途径。 10.1 包含体的形成和复性 体内抑制方法： 降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达速度和降低表达量； 将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表达过程中缺乏的辅助因子； 使用非代谢性碳源降低代谢速度和蛋白质表达量； 将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达 10.2 包含体的纯化和溶解 10.2 包含体的纯化和溶解 10.2 包含体的纯化和溶解 10.3 蛋白质复性 两种折叠过程假说： 一种假说认为肽链先形成二级结构，而后二级结构之间进行组合，最后排列成三级结构； 另一种假说认为蛋白质的折叠首先是肽链内部疏水性基团的识别并产生一个塌陷过程，然后调整形成不同层次结构，最终折叠成有活性的构象。 10.3 蛋白质复性 现有的主要复性方法： 稀释复性、 添加剂辅助复性、 分子伴侣或人工分子伴侣辅助复性、 反胶团的应用、 色谱柱复性等。 具体如下 10.3 蛋白质复性 10.3 蛋白质复性--稀释复性 稀释复性 为提高收率，通常要在较低的浓度下进行蛋白质复性操作，但降低蛋白质浓度会增大复性液的体积，为后续的分离纯化增加困难。 流加复性法 针对此问题，提出了流加复性法： 向 复性液中 脉冲加入变性蛋白质溶液，或连续流加到复性液中。 由于在流加变性蛋白质的同时复性液中蛋白质发生折叠复性，使变性蛋白质浓度始终保持在较低水平，最终可在较高的蛋白质浓度下获得较高的复性收率。 10.3 蛋白质复性 一般认为辅助蛋白质复性的添加剂 主要有两种作用： 1、稳定天然态蛋白质的结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性； 2、提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度（稳定性）。 10.3 蛋白质复性 5、包含体蛋白质复性中，如利用盐酸胍或尿素溶解包含体，优先考虑调节盐酸胍或尿素浓度获得较好的复性效果。 6、后续的分离过程中，需考虑表面活性剂类添加剂的去除 10.3 蛋白质复性 10.3.4 复性色谱 略。 详见 P395 凝胶过滤色谱 变性蛋白质吸附色谱 固定化辅助因子 10.3.5 反胶团中的蛋白质复性 10.3.6 复性过程 利用稀释添加剂应注意： 1、添加剂辅助蛋白质复性的作用具有选择性。 2、对于稳定折叠中间体或伸展肽链的添加剂，其辅助作用存在最佳浓度或浓度范围。 3、添加剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度有关。 4、利用添加剂提高复性收率的同时，会降低蛋白质的折叠复性速率，增加复性时间。 10.3.3 分子伴侣和人工分子伴侣 分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份 人工分子伴侣：模拟天然分子伴侣的辅助作用，开发了人工分子伴侣。 见P395 * * 通过本章学习，要求 了解包含体概念的基础上， 理解包含体形成的原因 及蛋白质复性