bk ca通道α亚基酪氨酸磷酸化在休克vhr中的作用及其调控word格式论文.docxVIP

BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化在休克 VHR 中 的作用及其调控摘要血管低反应性(vasohyporesponsiveness VHR)是创伤/休克等外科危重病人循环衰 竭及机体死亡的重要原因但机制不清研究显示失血性休克不仅可引起 PTK 活 性的增强且干预由 PTK 介导的蛋白酪氨酸磷酸化可恢复失血性休克及脓毒性休克 动物阻力血管的反应性提示蛋白酪氨酸磷酸化与休克血管低反应性形成有关但 究竟是何种蛋白的酪氨酸磷酸化在休克血管低反应性形成中起重要作用尚未见报 道我们以前的工作显示阻力血管 BKCa 通道的激活是休克后血管低反应性形成的 重要原因BKCa 通道亚基不仅具有与通道活性调制有关的酪氨酸磷酸化位点且 亚基酪氨酸磷酸化也是调控血管平滑肌细胞 BKCa 通道开放的重要机制之一提示 BKCa 通道亚基可能是休克诱导蛋白酪氨酸磷酸化的下游信号靶蛋白故本实验以 大鼠失血性休克为模型采用分子生物学膜片钳及离体血管张力测定等手段旨 在阐明 (1)失血性休克对大鼠肠系膜上动脉平滑肌细胞 BKCa 通道亚基酪氨酸磷酸 化的影响及其调控 (2)BKCa 通道亚基酪氨酸磷酸化在休克血管 BKCa 通道活化及在血管低反应性形成中的作用(3)NO/ET-1 诱导休克血管低反应性形成与 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化的关系及信号途径 目的是为阐明失血性休克血管低反应性形成的 分子机理以及寻求改善休克血管低反应性的新型药靶提供依据主要研究结果及结 论如下1. 采用免疫沉淀(IP)及免疫杂交(WB)技术 发现失血性休克(30mmHg 2h 及 4h) 可时间依赖性诱导大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌细胞 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化 的增强 采用原代培养的大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌细胞 证实血管平滑肌细胞 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化与 PTK/PTP 介导的信号途径有关2. 采用细胞吸附式膜片钳技术发现失血性休克大鼠肠系膜上动脉血管平滑肌 细胞 BKCa 通道被过度激活表现为通道开放概率增加单通道电导增加通道慢关 闭时间常数及平均关闭时间减小通道开放对电压的敏感性显著增加PTK 抑制剂 GST 可明显抑制通道开放概率延长通道关闭时间降低通道开放对电压的敏感性 而 PTP 抑制剂矾酸钠可逆转 GST 的这一作用提示由 PTK 介导的酪氨酸磷酸化与 休克血管 BKCa 通道活化有关进一步采用离体血管环张力实验证实PTK 抑制剂GST 可在一定剂量范围内有效恢复休克大鼠肠系膜上动脉对 NE 的收缩反应性 而PTP 抑制剂矾酸钠可使业已降低的休克血管反应性进一步降低 0.1mM TEA 可部分 抑制矾酸钠的这一作用(小于等于 1mM 的 TEA 被认为可特异性阻断 BKCa 通道) 提 示由 PTK/PTP 介导的 BKCa 通道酪氨酸磷酸化参与了休克血管低反应性降的形成3. 采用 L-精氨酸及内皮素(ET-1)诱导体外血管低反应性模型进一步探讨由 PTK/PTP 介导的 BKCa 通道酪氨酸磷酸化在 NO/ET-1 诱导血管低反应性形成中的作用 结果显示0.1mM TEA 可部分恢复 L-精氨酸及 ET-1 诱导的血管低反应性提示 L- 精氨酸及 ET-1 诱导血管低反应性与 BKCa 通道有关PTK 抑制剂 GST 可部分恢复 L- 精氨酸及 ET-1 诱导的血管低反应性而 PTP 抑制剂矾酸钠可使 L-精氨酸及 ET-1 引 起血管反应性进一步降低0.1mM TEA 可部分抑制矾酸钠的这一作用提示 BKCa 通道酪氨酸磷酸化至少部分与 L-精氨酸及 ET-1 引起血管收缩反应性降低有关 在原 代培养的大鼠肠系膜上动脉平滑肌细胞L-精氨酸可剂量依赖性诱导 BKCa 通道亚 基酪氨酸磷酸化增强 cGMP 结构类似物 8-Br-cGMP 可引起与 NO 相似的 BKCa 通道亚基酪氨酸磷酸化 且 L-精氨酸诱导的 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化可被 PKG 抑制剂(KT-5823)部分阻断 提示 NO 诱导的 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化与 cGMP/PKG 依赖的信号途径有关 ET-1 也可剂量依赖性诱导 BKCa 通道 亚基酪氨 酸磷酸化增强 cAMP 结构类似物 8-Br-cAMP 可引起与 ET-1 相似的 BKCa 通道 亚 基酪氨酸磷酸化 且 ET-1 诱导的 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化可被 PKA 抑制剂 (H-89)部分阻断 提示 ET-1 诱导的 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化与 cAMP/PKA 依 赖的信号途径有关总之 失血性休克不仅可诱导 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化的增强 且 BKCa 通道 亚基酪氨酸磷酸化是失血性休克血管 BKCa 通道激活及血管低反应性形成的重 要原因之一 NO/ET