blys1芽孢杆菌np1蛋白酶基因的高效表达及其酶性质分析word格式论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘要 本实验所用的产 NP 蛋白酶的芽孢杆菌 BLYS-1 是本课题组 2008 年于宜昌土壤中 分离并保存。经过初步研究发现 NP 蛋白酶在适宜的水解条件下能够将大豆蛋白彻底 水解成小分子肽，并且水解产物无苦味，具有很好的开发潜力。为提高 NP 蛋白酶的 表达量，设计使用强启动子 cry3A 与 pHT304 质粒构建表达载体，转化苏云金芽孢杆 菌无质粒突变株 BMB171 得到两株重组苏云金芽孢杆菌。通过发酵产酶实验对 cry3A 启动子不同长度片段启动蛋白酶表达的能力进行了研究，实验结果表明 pro3Ab 启动 蛋白酶表达的能力明显高于 pro3Aa。对这两株重组菌进行了高表达，易纯化，高产 酶活性研究，并对 NP 蛋白酶的特性进行了初步研究。主要包括以下研究内容： 以 BLYS-1 芽孢杆菌为出发菌，通过 DPS 软件进行均匀实验设计，综合各因素 对 BLYS-1 芽孢杆菌产酶的影响，探索出最适宜的产酶条件组合。通过稀盐酸沉淀法 分离纯化了 NP 蛋白酶，并确定 NP 蛋白酶的最适水解条件为 pH8.0、温度 60℃和酶 活持续时间 4h。以豆浆为低物对 NP 蛋白酶的水解性能进行了研究，在 50℃ 水解 4h 能够将豆浆中 30-100 KDa 的大分子蛋白彻底水解成 2-4 KDa 的小分子多肽。通过 Native和 SDS对 NP 蛋白酶的结构组成进行了研究，活性蛋白的分子量 为 110 KDa，共有 3 个 35 KDa 的蛋白单体组成。 以 BLYS-1 芽孢杆菌总 DNA 为模板，通过一对引物成功克隆了 np-1 基因；以 T6 芽孢杆菌总 DNA 为模板，通过两对引物成功克隆了 cry3A 基因的启动子 pro3Aa 和 pro3Ab。将 pro3Aa 和 pro3Ab 与 np-1 基因组成融合基因并连接 pHT304 质粒，构 建 重 组 质 粒 pBLYS-3Aa-np 和 pBLYS-3Ab-np 。 以 重 组 质 粒 pBLYS-3Aa-np 和 pBLYS-3Ab-np 电 击 转 化 BMB171 ， 成 功 筛 选 出 两 个 转 化 子 BLYS-3Aa-np 和 BLYS-3Ab-np，对这两个转化子进行产酶实验，证明两株重组菌可成功表达蛋白酶。 对重组菌 BLYS-3Aa-np 和 BLYS-3Ab-np 进行发酵产酶试验，通过 Native结合干酪素平板对产酶条件进行了探索。Native测定重组菌发酵液中蛋白酶分 子量为 110 KDa，SDS测定重组菌蛋白酶亚基为 35 KDa，与 BLYS-1 发酵液测 定结果一致，说明重组菌成功表达了 NP 蛋白酶。重组菌 BLYS-3Ab-np 表达 110 KDa 蛋白酶的活性高于 BLYS-3Aa-np 和 BLYS-1，说明 pro3Ab 启动子具有强的启动转录 的能力，构建的高表达菌株成功。 对 发 酵 液 用 Folin- 酚 法 测 酶 活 ， 测 得 的 结 果 为 BLYS-3Aa-np （ 65U ） BLYS-3Ab-np（97U）BLYS-1（106U）。参考发酵液 Native结果，蛋白酶条 带亮度变化为 BLYS-3Aa-np BLYS-1 BLYS-3Ab-np，BLYS-1 发酵液中有多条蛋白 条带，推测有其他蛋白参与了 BLYS-1 发酵液的水解过程，或者 NP 酶的水解过程有 III III 其他蛋白参与了调控，导致重组菌 BLYS-3Ab-np 表达 NP 蛋白酶的能力高于 BLYS-1 但发酵液酶活却比 BLYS-1 低。 关键词:蛋白酶; 基因克隆 cry3A 启动子;芽孢杆菌;蛋白酶高效表达 PAGE 4 PAGE 4 Abstract Protease，hydrolyzing the the proteins molecule into smaller ones by breaking the peptide bonds under suitable conditions ，is a kind of proteolytic enzyme which is of great value in the application of biological domains. Numerous proteases have been obtained and commercialized，but the large-scale industrial application has been constrained by a series of factors. In this article，a Bacillus subtilis strain BLYS-1