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Aβ1－40 脑内注射毒性损伤及远志皂苷保护机制的研究Aβ1－40 脑内注射毒性损伤及远志皂苷保护机制的研究研 究 生：张道宏 指导老师：陈勤中文摘要阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是以记忆力减退、认知功能障碍及神 经功能受损为主要临床特征的神经退行性疾病，是一种老年性疾病，与机体和 年龄的老化密切相关。其病理特征表现为神经细胞内出现神经纤维缠结、细胞 外存在老年斑以及神经元变性或凋亡，且主要分布在前皮质和海马区。其病因 及发病机制尚不清楚，治疗上也缺乏有效的方法和手段，因此需深入的研究。 目前由于缺乏模拟 AD 的理想动物模型，AD 的基础研究和药物开发尚未取得 突破性进展，因而有待建立理想的和适用的 AD 动物模型；由于 AD 患者脑组 织中 β 一淀粉样蛋白(Aβ)的沉积是促使 AD 发生发展的重要原因，因而研究 Aβ 沉积所诱发的神经元毒性是探讨 AD 的老年斑及神经纤维缠结形成的分子机 制，且是当前神经生物学领域研究的重要课题之一。本课题拟脑定位注射 Aβ1－40 建立 AD 大鼠模型，通过研究 Aβ 沉积后脑内自由基代谢的紊乱和神经元 细胞骨架的损伤所致的神经细胞凋亡来探讨 AD 发病的分子机制，并通过研究 益智中药远志有效成分远志皂苷对神经元的保护作用机理，旨在为今后临床应 用提供实验基础。目的：1.研究 Aβ1-40 对大鼠海马神经元的毒性作用和远志皂苷的保护作用。2.研究 Aβ1-40 对大鼠海马神经元细胞骨架的毒性作用和远志皂苷的保护作 用。3.探讨 Aβ1-40 对大鼠海马神经元细胞线粒体的损伤和远志皂苷的保护作用。 方法：1.通过脑定位仪在大鼠海马区内注射 Aβ1-40 建立 AD 模型，并用远志皂苷 连续灌胃 25 天。用 HE 和刚果红染色观察 Aβ1-40 对大鼠海马神经元的毒性作用中文摘要及远志皂苷对海马神经元损伤的保护作用；免疫组织化学方法观察 AD 模型大鼠海马神经元细胞凋亡情况及远志皂苷的保护作用。2.应用免疫组织化学方法观察 Aβ1-40 对大鼠海马神经元细胞骨架损伤程度 及远志皂苷的保护作用。3.采用生物化学方法测定大鼠神经元细胞线粒体内 SOD 活性和 GSH-PX,MDA 的含量及 ATP 合成。 结果：1.大鼠海马区内注射Aβ1-4025天后，神经元形态和凋亡数量均发生变化，HE 和刚果红染色结果显示神经元数量减少，胞体退化，胞核固缩深染，核小，呈 扁圆形或三角形，核仁不明显；胞质较少，少量细胞出现空泡性变化；药物组 动物用药25天后，其神经细胞形态与模型组比较，神经元的数量明显增多，形 态也较完整。BCL-2免疫组织化学所得结果表明Aβ损伤造成了神经细胞Bcl-2高 表达，导致神经细胞的凋亡；远志皂苷组Bcl-2表达降低。2.通过免疫组织化学显示Aβ对神经细胞骨架蛋白tau蛋白、GFAP异常表达， 进而导致神经细胞骨架明显的损伤；远志皂苷使神经细胞骨架蛋白tau蛋白、 GFAP异常表达量趋于正常，远志皂苷高剂量组与假手术组相比无差异；远志皂 苷高、中剂量与模型组比具有极显著性差异。3.应用生物化学方法检测到Aβ引起神经细胞线粒体内脂质过氧化产物 MDA含量升高，同时线粒体内SOD活性和GSH-PX含量下降，而且大脑线粒体 Na+K+ATPase﹑Ca2+ -ATPase ﹑Mg2+-ATPase的活性显著性下降，表明Aβ神经毒 性作用不仅使海马区脑组织自由基产生增加，自由基清除能力下降，同时导致 线粒体内的ATPase活性降低。远志皂苷升高细胞线粒体中抗氧化剂SOD﹑GSH-PX的含量，降低脂质过氧化产物MDA含量，提高线粒体内的ATPase活性。 结论：1. 大鼠海马区内注射Aβ1-4025天后，海马区神经元数量减少，胞体退化， 胞核固缩深染，核小，呈扁圆形或三角形，核仁不明显；胞质较少，少量细胞 出现空泡性变化。免疫组织化学所得结果显示神经细胞中Aβ蛋白大量沉积；并 且导致神经细胞中Bcl-2高表达；同时引起神经细胞骨架蛋白tau蛋白、GFAP也 异常表达，明显高于假手术组。生物化学方法检测到Aβ毒性作用引起神经细胞Aβ1－40 脑内注射毒性损伤及远志皂苷保护机制的研究线粒体内MDA含量升高， SOD活性和GSH-PX含量下降，同时大脑线粒体 Na+K+ATPase﹑Ca2+ -ATPase ﹑Mg2+-ATPase的活性也显著性下降。结果提示Aβ 蛋白对大鼠神经元细胞产生毒害作用，引起神经元细胞骨架和线粒体损伤，导 致细胞凋亡。2．远志皂苷连续25天灌胃治疗后，脑神经元的数量明显增多，形态也较完 整，明显好于模型组，与假手术组比无统计学意义；Aβ蛋白沉积减少，神经细 胞骨架蛋白tau蛋白、GFAP表达量和线粒体产生的自由基也接近正常，提示远志皂苷