基化CpG结合蛋白2(MeCP2)基因克隆和Westem检测.docVIP

基化CpG结合蛋白2(MeCP2)基因克隆和Westem检测 　　摘要：DNA的甲基化作用作为一种常见的表观基因修饰方式广泛存在于生物体内，与DNA甲基化密切相关的蛋白――甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)在DNA甲基化中起着非常显著的作用。通过浅谈DNA甲基化的作用及MeCP2的相关功能，并且构建了可表达MeCP2的载体，为进一步研究MeCP2在肿瘤和Rett综合症中的作用打下基础。 　　关键词：表达DNA甲基化　甲基化　CpG结合蛋白2(MeCP2)　克隆　Rett综合症 　　中图分类号：Q71　文献标识码：A　文章编号：1007-3973(2011)004-087-02 　　 　　1　概述 　　 　　DNA甲基化对基因的表达有抑制作用，而去甲基化则可以恢复基因表达的活性。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化位点进行甲基化。结构基因含有很多CpG结构，CpG和GpC中两个胞嘧啶的5位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。 　　哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1％，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度却很高，可以达均值的5倍以上。基因组中60％-90％的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛，大约含有500多个碱基，CpG岛位于结构基因启动子的核心序列和转录起始区域，一般是第一个外显子区。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是处于甲基化状态。 　　DNA甲基化对基因表达的抑制作用是由于特异性结合于甲基化CpG位点的蛋白所造成的，这种蛋白被称作转录抑制子，或者甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)。哺乳动物甲基化的主要方式是形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，以甲基CpG(mCpG)形式出现，MeCPs特异地识别mCpG，对mCpG周围序列无特异要求，因而能广泛参与基因转录抑制。已经鉴定的MeCP家族成员有5个，即MeCPl、MeCP2、MBDl、MBD3和MBD4，其中MeCP2在细胞中含量丰富，并且能与含一个甲基CpG岛的DNA结合。 　　MeCP2在体外特异性的与甲基化DNA结合，在体内，其-在染色体中的分布依赖于甲基CpG。在小鼠中，MeCP2集中在中心粒异染色质上，在这里含有大部分(约40％)的5-甲基胞嘧啶。异染色质定位实验表明，完整的MeCP2蛋白被定位于野生型细胞的异染色质上，但低水平基因DNA甲基化的变异细胞只有较少的蛋白定位于异染色质。在MeCP2的删除实验中表明，异染色质上的定位需要85个氨基酸的与甲基-CpG结合的结构域。以上实验结果说明MeCP2在体内是一个与甲基-CpG结合的蛋白质，并可能是DNA甲基化下游序列的主要调节介质。 　　MeCP2是一个丰富的染色体蛋白，大小约84kD，含有4个外显子，它广泛存在于哺乳动物的体细胞中，尤其在脑组织中最丰富，但在早期胚胎细胞中很少表达。每个细胞核中约有1×105～5×105个MeCP2分子，比MeCPl高1～2个数量级。人类MeCP2基因定位于染色体Xq28，编码的蛋白质主要有两个功能域，N端85个氨基酸是甲基CpG结合功能域(methyIbindingdomain,MBD)，可与单一mCpG结合；c端104个氨基酸是转录抑制功能域(transeriptional repression domain，TRD)。 　　为了评价MeCP2的功能意义，Tate用含有一个Lae报告基因的无启动子靶基因结构，使雄性小鼠胚胎干细胞x联结基因发生变异。缺乏MeCP2的变异ES细胞的生长与父本一样，还能相当程度的分化。但从几个独立变异株衍生的嵌和胚胎却出现发育缺陷，其严重程度与变异细胞的分布里正相关。结果提示与DNA甲基转移酶一样，MeCP2在干细胞中是非必需的，但对胚胎发育却是必不可少的。Nan发现野生和重组大鼠MeCP2在体外抑制甲基化启动子的转录，但不抑制非甲基化启动子的转录。而且，MeCP2能在含甲基?CpG的组装前染色质中替换组氨酸H1(H1FI)。这些性质，再加上丰富的MeCP2和高频率的2-bp结合位置，提示MeCP2在脊椎动物基因组中可能起着普遍转录抑制因子的作用。对MeCP2抑制作用的机制的研究发现MeCP2以甲基化依赖的模式与染色体紧密的结合。它的转录抑制结构域能在一定距离内起作用。实验证明MeCP2的TRD与一个共抑制复合物协同起作用，此复合物含有转录抑制因子mSin3A和组氨酸乙酰基转移酶(HDACl)。体内的转录抑制可被去乙酰基转移酶抑制因子trichostatin