SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因拼接的应用研究.docVIP

SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因拼接的应用研究 第25卷第3期 2006年8月 大豆 SOYBEAN 科学 SCIENCE Vol_25No.3 AUff.2006 SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因 拼接的应用研究 宋柬马会勤.陈尚武 (1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.中国农业大学果树学系,北京100094) 摘要利用SOE(SplicingbyOverlapExtension)法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)的两个外显子 进行拼接,得至lJL完整的PAL基因,表明这种方法是有效可行的.这种技术是作为对cDNA克隆的 初步改进与尝试,节约了成本,有一定的应用价值. 关键词SOE法;cDNA克隆;苯丙氨酸解氨酶(PAL) 中图分类号S565.1文献标识码A文章编号1O0O一9841(2006)03一O228一O6 1989年,Horton等人提出了SOE法(Gene SplicingbyOverlapExtension,GeneSOEing),即 通过复制时DNA链的交错延伸实现基因拼接[1]. 该方法是利用PCR技术在体外进行有效的基因重 组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,该技术使 用简易.由于引物只需要与模板有效结合,尤其是 5端序列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5 端可以添加两种酶切位点以便于后期克隆[2]. SOE法正是利用这一特点,使两个基因出现一个重 叠区域,进而利用这段重叠区制造长引物(mega primers),使基因拼接或重组得以实现【4],SOE原 理示意图如图1所示.利用这一方法,把大豆中的 苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的两个外显子拼接在一 起,与从mRNA反转录为cDNA的技术路线相比, 简化了克隆方法,节约了成本,降低了RNA污染降 解的风险. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1植物材料 大豆(Gtycinemax(L.)Merr.)栽培品种东北 春大豆系列(北丰12)幼嫩叶片. 1.1.2质粒和菌种 质粒pGEM—T—EasyT载体试剂盒购自 Promega公司;大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a 为本实验室保存. 1.1.3工具酶及其它试剂 限制性内切酶,T4DNALigase,ExTaqDNA 聚合酶,PyrobestDNA聚合酶,dNTP, DL2000DNAMarker等购自TaKaRa公司;琼脂糖 凝胶DNA回收试剂盒(QIAquickGelExtraction Kit)为QIAGEN公司产品,质粒DNA小量提取试 剂盒购自泽星科技公司(北京);Tryptone和Yeast Extract为OXOID产品;琼脂糖为西班牙产品;X— Gal,IPTG,氨苄青霉素等药品均为进口或国产生物 试剂. 1.2方法 1.2.1大豆DNA提取纯化 利用CTAB法进行DNA的提取纯化,稍有改 进.原理方法参见文献[6]. 1.2.2引物设计与合成 ? 收稿日期:2006—03—23 基金项目:国家自然科学基金资助项目(Ieemnumbermp 作者简介:~(1980-),女,中国农业大学食品科学与营养工程学院,硕士研究生,主要从事食品分子生物学研究,电话:010—--mail:songirlike@163.corn 通讯作者:陈尚武,swchen@ 3期宋柬等:SOE法对大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因拼接的应用研究229 外显子1引物序列: F1:5一TTCATATGGAAGCAACTAATGB1:5一AAGGAACTCATCAGGTAACT NdeI 外显子2引物序列: F2:5一TCCTTTTCAGATTCTTAAACGCTGGB2:5一TTCTCGAGCTTGCATAGGTAC XhoI 重组PCR引物序列: F3:5一GTGCTCTGCAGAAGGAACTCATCAGATTCTTAAACGCTGGAATATTTGG AAATGGAACTG一360bp B3:5--CCAAATATTCCAGCGTTTAAGAATCTGATGAGTTCCTTCTGCAGAGCAC CACCCTGTTTG--360bp 其中引物F3和B3划线部分互补,为上海生工 合成;常规引物F1和B1,F2和B2为赛百盛合成. 1.2.3PCR扩增 GMPAL外显子1,2的扩增采用25l的标准 体系(表1). 表1PCR反应体系 Table1PCRreactionmixture PcR反应体系用量终浓度 PCRrecflonmixture ddH2O l0×PCRBuffer(Mg2+plus) dNTP(2.5mMeach)Mixture Primer1(2.5pmol/M) Primer2(2.