膜片钳技术在药学研究中的应用.docVIP

膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词 膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 膜片钳技术原理及特点 膜片钳技术通过玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接，可以测到1pA的电流灵敏度，1㎜空间分辨力及10ms时间分辨力，为从分子水平了解生物膜离子通道的开启和关闭、动力学、选择性和通透性等膜信息，提供了直接手段。膜片钳技术对膜电压的钳制是通过负反馈回路而实现的。这种负反馈电路要求细胞膜电位在所有时间都与经放大器输出的指令电压相等。当由于离子通道的开放造成膜电位与指令电位之间发生差异时，微电极放大器就通过记录电极向胞内自动注入大小相等和方向相反的电流而使膜电位得以钳制。通过记录放大器用以维持细胞膜钳制电位所输出的电流大小，即可推算出由于离子通道开放所产生的电流的大小，以及由此导致的膜电导的改变。 膜片钳技术有不同的记录方法，如细胞贴附式、全细胞式、内面向外式、外面向内式等。根据研究目的和观察内容的不同，可采取相应的记录方法。此外，还有穿孔膜片钳记录、带核膜片记录、人工脂膜的膜电流记录等其它记录方式。 表1 膜片钳记录模式[5.6] 记录模 式 形成方式 优点 缺点 常规全细胞记录模式 形成高阻封接后，向毛细管内施加负压吸破细胞膜，即形成全细胞记录模式 串联电阻小，细胞不容易受损而死，可对许多常规微电极不能研究的小细胞进行研究，实验中有好的信噪比；可以控制细胞外成分就某种离子进行针对性研究，可在电流钳下做动作电位。 细胞内可流动的小分子能渗漏到电极液中，被电流迅速失活 细胞贴附式 将微吸管吸附于膜表面，形成高阻封接即可 直接施加负压对膜片进行电压钳制，可以在保持细胞内正常环境时对离子通道的活性进行观察监测 不能人为控制细胞内环境，不能准确测量胞内电压，外液中加入的刺激剂无法到达与电极内液接触的细胞外表面 膜内面向外式 形成全细胞模式后，将微吸管提起使膜片与细胞体分离，尖端形成的小泡几秒后破裂即形成此模式 可直接且自由地经外液介导而调节细胞内液环境，并可在和细胞活动无关的条件下记录到单一离子通道的活动 因有细胞质渗漏可能会出现下落迹象 膜外面向外式 形成全细胞