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如何做好细胞培养实验？ —— 陈冬 基本概念 体外培养的三个层次： 细胞培养、组织培养、器官培养 细胞培养的优点： 细胞培养的不足： 离体人工环境与体内环境差异，实验结果不能轻易由外推内。原代细胞具有更接近体内细胞的特性。 培养细胞形态分类 （一）贴壁型 1.成纤维型细胞：梭形或不规则三角形 2.上皮型细胞：密集排列成膜；整块膜移动；Netting（网眼状孔洞） 3.多形型细胞：神经组织的细胞 4.游走型细胞：形状常发生变化。 （二）悬浮型 血液白细胞等 细胞形态改变的因素 细胞培养条件较好且连贯时，细胞形态相对稳定； 可能导致形态改变的因素： 培养条件改变如温度、PH值等； 细胞密度的高低； 细胞发生转化； 细胞被支原体污染等。 组织细胞培养生命周期 原代培养（Primary culture）期 克隆形成率低、与体内细胞相似度高 传代培养期 细胞系、一般可传代10-50代 衰退期 转化、永生性、无限细胞系、多为异倍体 细胞培养一代生存期 细胞培养一代与细胞倍增 细胞培养一代——细胞倍增3-6次 细胞培养一代过程： 悬浮——贴附——延展 潜伏期 原代细胞（24-96h以上） 细胞系 （6-24h） 细胞密度的影响 指数生长期 分裂指数（MI）、PH和血清浓度的影响、接触抑制与密度抑制 停滞期 传代 图 细胞生长的条件 无污染（无毒无菌、代谢产物及时清除） 温度 人和哺乳动物 37℃ 耐低不耐高 CO2与PH值： CO2 的作用主要是维持液体的PH值 （5%） 耐酸不耐碱 细胞生长所需物质： 糖、氨基酸、维生素、生长因子、其他元素类物质 渗透压 培养基： 合成培养基 + 血清 + 特殊生长因子 血清的作用 血清的种类： 血清的成分： 含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质等。 血清的使用浓度： 0% 能短暂生存，不能增殖 5% 能维持细胞不死及缓慢生长 10%-20% 细胞顺利增殖生长 细胞培养实验前的准备 超净工作台： 直流式（从上往下吹）、紫外灯 超净工作台内物品： 斜瓶架、酒精灯、移液器架、废液缸、 吸球、试管架、镊子、打火机等 灭菌物品 放置于无菌间的边台，随用随取 培养箱 37℃ 5% CO2 95%湿度 注意：放入和取出细胞时必须戴口罩、手套。 倒置相差显微镜 纯水及超纯水 超纯水：用于配制细胞培养所需的缓冲液和培养基，以及色谱分析等，是最高级别的水 纯水：用于普通用途的缓冲液配制。 过滤装置 对配制好的缓冲液，培养基，胰酶等不能进行高温高压灭菌的细胞培养用试剂进行过滤除菌，使用前需要先高温高压灭菌。 培养用容器 常用玻璃器皿清洗(细胞培养) 细胞培养瓶、细胞移液管、试剂瓶、血清瓶、载玻片及盖玻片 浸泡刷洗（洗衣粉）、冲洗(自来水) 、酸泡（12-24小时）、自来水冲洗10-15次、蒸溜水冲洗3次、双蒸水冲洗3次(细胞培养) 、56℃烘干 细胞培养用液的配制 缓冲液： PBS (四盐)：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml PBS(三盐配方) : NaCl 9 g Na2HPO4.12H2O 6 g NaH2PO4.2H2O 0.4 g 以上两种均为0.01M配方,主要用于细胞培养实验中 Hanks液：含Ca2+、Mg2+ 、Glucose的缓冲液 D- Hanks液：不含Ca2+、Mg2+的改良型Hanks缓冲液 胰 酶：将胰酶粉末用不含Ca2+、Mg2+的缓冲液配置成0.25%的浓度