4-1沉淀方法教学讲义.pptVIP

第四章 分离纯化常用技术、原理及方法;;沉淀法;一、沉淀法分离蛋白质;在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。;1. salting in – proteins are less soluble at very low salt concentrations (ionic strength); salt ions helps shield proteins multiple charged groups. ; 2. salting out – proteins are also less soluble at salt concentrations (high ionic strength) because the salt ions bind most of the water molecules ;;;;分段盐析;脱盐: desalting process dialysis;透析示意图;;Simple figures to dialysis;与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个： 降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。 是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。;凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 ;; 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。 ; 室温下，有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。 ;（三）蛋白质沉淀剂;（四）聚乙二醇沉淀;（五）等电点沉淀;;二、沉淀法分离核酸;（1） 加去污剂;用酚、氯仿抽提：这两种有机溶剂是除蛋白 的变性剂。 离心，水相（含核酸）移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。 ;2、核酸沉淀;沉淀的时间和温度与核酸的碱基对数和浓度等有关： －－DNA片断1kb或浓度，置－70°须数小时到十几小时，经高速离心（16000rmin，15min）才能得到核酸； －－DNA片段1kb的核酸溶液（以其它核酸作助沉淀剂），置室温下仅需数分钟，经高速离心即可得到核酸。 ;异丙醇 在含DNA(或大分子rRNA）的溶液中，加入0.3mol/LNaAC及 0.54～1倍体积的异丙醇 ，放置短时间后，离心可得核酸沉??物质，而多糖及小分子RNA则在上清液中。;（2）聚乙二醇 加聚乙二醇－0.5mol/LNaCl溶液到核酸溶液中，可使2kb的DNA片段沉淀出来。 PEG的浓度与DNA片段的分子质量成反比。 1.65kb的DNA，用5％PEG， 1.2kb的DNA，用6％PEG， 0.6kb的DNA，则用7％的PEG。 通常采用阶梯式PEG浓度（5％，6％，7％）分别将上述三种DNA片段分开。;（3）十六烷基三甲基溴化铵 在多糖含量较高的核酸溶液中，加入1％CTAB及0.35M/LNaCl，可得到CTA－核酸沉淀物，多糖滞留在溶液中。 再用0.1M/L的NaAc－70％乙酸洗涤，将CTA从沉淀物中置换出来，离心后存在于上清液中，而核酸形成钠盐，在70％乙醇中仍为沉淀物。;沉淀法小结