3引物设计及测序结果分析(2016教案)教材课程.ppt

引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer 引物有哪些信誉好的足球投注网站选项设定 引物类型 有哪些信誉好的足球投注网站模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 有哪些信誉好的足球投注网站结果 28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer 引物编辑 引物分析 首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。 二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。 第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。 第四False priming 检查 引物编辑 Edit primer here Analysis the edit result Accept the edit result Return to the main window 二、引物设计提高篇 用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1 SP pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP SP BamHI pcDNA3.1 NR1 Plasmid 1: Plasmid 2 GFP 第三章 引物设计及测序结果分析 一、引物设计基础 二、引物设计提高篇 三、 测序结果分析 引物 是一段特定的DNA序列，可以在退火温度下和模版链特异性结合，引导PCR体系中的dNTP根据与模版链碱基配对原则延伸出一条新的链． 引物的序列是根据要扩增的DNA序列而设计的． 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 一、引物设计基础 引物设计流程： 1）序列查找下载； 2）序列同源性比较； 3）引物设计与筛选； 4）加工修饰； 5）评价分析； 6）实验验证 引物设计原则 引物设计软件 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件primer premier 5或美国whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序primer3来设计引物。 引物设计操作流程 1.序列下载 （序列查找根据所需检测的病原体或者待检特定基因，在/pubmed 网址查询有关序列。 ） ↓ 2.同源性比较 （寻找保守序列设计引物） （在/blast/blast.cgi 网址进行在线的两两比较） ↓ 3.引物设计筛选 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 2.碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%，以45-55为宜。GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。 有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。 3.引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般差异控制在2 ℃以内。 （引物的退火温度相差小于5℃一般不会影响PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55℃～70℃间变化）一般采用较低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度。 一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5端加上一些G或C，若G＋C含量太高，可在5端加上一些A或T。 4.引物二级结构 引物二聚体（引物间不应有多于4个连续碱基的同源性？或互补性 ） 所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp ） 发夹结构：DNA通过自身回折使得