(精选)诊断酶学课件.ppt

（1）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。 S P E + 试剂 可被检出的物质 （2）酶偶联法 目前应用最多，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。 （二）酶偶联反应 反应模式 A B P Ex Ei 被测酶 被测酶 始发反应 始发反应 指示反应 指示酶 指示反应 指示酶 A B C P Ex Ea Ei 辅助酶 辅助反应 酶偶联体系 辅助酶 辅助反应 1. 酶偶联反应时相 酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下： L-丙氨酸＋α-酮戊二酸 α-丙酮酸＋ L-谷氨酸 α-丙酮酸＋NADH 乳酸＋NAD+ ALT LDH 此时反应的方向由NADH转变为NAD，随反应进行，A应随之而下降，通过检测反应产物A在340nm处A的变化速率，可以检测指示酶反应。 ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保温5m，将样品中所含的内源性α-酮酸消耗完。然后再加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应。 反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质（内源性α-酮酸）消耗完。 加入试剂2（即α-酮戊二酸）启动反应，在初始阶段，产物α-丙酮酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的Vx。 随着产物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反应V相同，达到稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。 最后由于底物的消耗，反应V逐渐减慢，偏离线性。 1．酶偶联法 指示酶的反应系统： 以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物NAD（P）H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下，其在460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统 ； 是偶联过氧化氢（H2O2）以过氧化物酶（POD）为指示酶的测定系统。 Trinder反应： 2. 酶偶联反应注意事项 (1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。 (2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反应V应超过或等于Vx，Ei反应必须是一级反应，即指示酶反应速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。 (3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶（指示酶）制剂。 (4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。 （三）干扰因素 (1)其他酶和物质的干扰 (2)酶的污染 (3)非酶反应 (4)分析容器的污染 (5)沉淀形成 解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。 P151 五、血清酶活性浓度测定条件的优化 方法 仪器设备 试剂 自动生物化学分析仪参数设置 标本的采集、运输与保存 标本的采集、运输与保存 溶血：细胞内酶而言，细胞内外浓度差异大；所以应及时进行分离，静脉采血后应在1～2h内分离血清。 抗凝剂：利用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA抗凝的血浆一般不用作酶活性测定；肝素对ALT、AST、CK、LD、ACP检测均无影响，可用于急诊；临床多用血清为首选测定标本。 温度：大部分酶在低温中比较稳定，一般在血清分离当天测定，否则应放冰箱冷藏；通常在0～4 °C下使用、处理及保存，除了一些冷变性的酶；液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。 P155 六、酶活性浓度单位 （一）酶活性单位 惯用单位 用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位，即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位，参考值差别很大。 国际单位 1963年，1IU＝1μmol/min （25 °C 及其他最适条件下） 1976年， 1U＝1μmol/min（特定条件下） 1979年，1Katal＝1mol/s（规定条件下），1U＝16.67nKatal 例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS） 【单位定义】 1惯用单位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。 【操作】 测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4