分子生物学第10章基因组与比较基因组学.pptVIP

第十章　基因组与比较基因组学 测序步骤： ①用M13噬菌体做载体获得单链DNA模板，克隆并扩增待测DNA片段，使其变性。 ②选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。 ③引物先同单链模板复性。 ④在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow 酶)以及不同的ddNTP。 ⑤进行聚合反应 ，DNA新生链延长，当掺入ddNTP时，聚合反应终止。 ⑥在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶中电泳。 ⑦根据X底片对凝胶曝光所显的条带位置，读出 DNA序列。 Shotgun法序列拼接 　ＤＮＡ的鸟枪法测序的优缺点  美国政府决定于 1990年正式启动HGP，预计用 15 年时间，投入 30 亿美元，完成 HGP。 由国立卫生研究院和能源部共同组成“人类基因组研究所” 逐渐地，HGP 扩展为多国协作计划。参与者包括：英、日、法、德和中国（1993年） 人类基因组计划的进展状况（1）截至 1998 年 10 月，完成 1.8 X 108bp，占 计划的 6％。（2）完成一系列模式生物全基因组测定。 这些模式生物全基因组测定的完成有重大理论与现实意义。 （3）DNA 测序技术飞速提高 1998.5.9 J.C. Venter 等宣布，组建商业公司，投入 3 亿美元，3 年内完成。 二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成 美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯·柯林斯在介绍情况。 人类基因组草图基本信息 由31.65亿bp组成 含3~3.5万基因 与蛋白质合成有关 的基因占2% 同时发表论文 美国 Science, Vol. 291, No. 5507  英国Nature , Vol.409, p.860 人类基因组计划的科学意义 （1）确定人类基因组中约3万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。 （2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。 （3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。 （5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据。 （6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。 （7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。 （8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。 　　 多态性：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性（Polymorphism）。 第一代多态性标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代多态性标记是短的串联重复序列 包括小卫星DNA和微卫星DNA，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化 第三代多态性标记是单核苷酸的多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP） （2）物理图 以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。 （3）转录图 以EST（expressed sequence tag ，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。 （4）序列图（分子水平的物理图） 序列