[工学]高效液相色谱2.pptVIP

正相HPLC 流动相极性小于固定相极性的情况即正相色谱(Normal Phase Chromatography)。正相色谱采用极性吸附剂（或极性键合相）如硅胶、氧化铝或带有氰基、二醇基和氨基的极性固定相，非极性流动相操作模式，依据溶质分子的极性大小进行分离。 溶质分子与固定相的硅醇基等极性基团产生特异的极性相互作用。 极性相互作用大的保留时间大，反之保留时间小。洗脱顺序：非极性、弱极性、极性。 应用：石油化工产品、染料、农药、医药、有机酸、有机碱等 反相HPLC 流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱 (Reverse Phase Chromatography)。非极性键合相色谱可作反相色谱。在现代液相色谱中应用最广泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。 保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大，对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶 氰基 C1(TMS) C3 C4 苯基 C8 ≈ C18(强)． 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 应用：小分子化合物、蛋白质、多肽等 离子交换HPLC 离子交换（ion-exchange HPLC）是用离子交换剂作固定相，根据不同组分在一定pH下，组分电荷性质和数量不同而分离的技术。 分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类 应用：核酸、蛋白质、氨基酸等 凝胶HPLC 凝胶色谱（gel HPLC）法又称分子排阻色谱法，是基于分子大小和形状的差异在具有多孔的凝胶分子筛中形成分子筛效应而分离分析的技术。 含有各种分子的样品溶液在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出。 应用：核酸、蛋白质、酶、多糖及小分子化合物等 亲和HPLC 亲和HPLC（affinity HPLC,AF- HPLC）是利用生物大分子间专一的亲和力进行分离的技术。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。 应用：酶、抗体、抗原、受体等 高效液相色谱的固定相和流动相 　　　 常见固定相柱填料 硅胶 十八烷基硅烷键合硅胶填充料，即C18柱或ODS柱，万能柱，适用于各种类型的生物分子。 短链烷基（C3、C4、C8等）＋大孔硅胶键合相，适用于氨基酸、小肽等生物小分子。 填料是非极性的，官能团为－CN、－NH2等 离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H、－COOH等 阴离子交换键合相－NH2、 －R4N+等 高效液相色谱的固定相和流动相 常见流动相溶剂 反相色谱常用流动相及冲洗强度 H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用组成：甲醇/H2O、乙腈/H2O 洗脱顺序：极性物先洗脱下来 正相色谱常用流动相及冲洗强度 正乙烷乙醚乙酸乙酯异丙醇 高效液相色谱分析 定性分析 　　高效液相色谱法是一种简单快捷的有机物定性分析的技术，已被广泛应用在科学研究，医药卫生、食品安全、化学化工等诸多领域。通常采用如下方法： 已知物对照法定性：利用保留特性和通过不同柱比较 　　 　　　在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R′或V R ′ ）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。 高效液相色谱分析 定性分析 色谱法和其他方法结合定性： 利用化学反应定性 利用二极管陈列检测器 收集峰的流出物 HPLC-MS 　　 高效液相色谱分析 定量分析 　　　高效液相色谱法是当前有机定量分析的主要方法，已在生物化学、生物工程、医药研究、临床检验、食品分析、环境监测、精细化工、高分子化工等领域得到广泛应用，是从事分析检验人员解决实际分析问题的有力工具。 定量方法： 峰面积归一法 外标法 内标法 内加法（或追加法） 峰面积或峰高的测量方法： 手测峰高 峰高乘半峰宽 剪纸称重 积分仪测定 微处理机测定 高效液相色谱技术与应用 （二）分离的基础 本节主要内容 分离度：总论 分离度的测量 最小分离度 分离度与分离条件的关系 溶剂强度的影响 选择性的影响 色谱柱理论板数的影响 进样量的影响 体积超载 质量超载 分离度 相邻谱