9大豆根瘤菌的粗分离.pptVIP

小组成员： 陈悦 周文茹 大豆根瘤菌的粗分离 大豆根瘤菌是和大豆共生，有很强固氮能力的一类杆状细菌。它为大豆提供丰富的氮源，故农业上经常在播种大豆时用根瘤菌拌种以取得好收成。进行实验室分离根瘤菌的实验，有助于大规模拌种，以及进行一系列对固氮的研究。 研究背景： 经根瘤菌拌种（右）和未经根瘤菌拌种的大豆（左） 大豆根瘤菌经常和一种名为bacterium tumefaciens的细菌混在一起，该细菌也能在豆科植物根上形成肿瘤。 杂菌在植物根部形成的肿瘤 1、粗提取大豆根瘤菌，从根瘤中分离 大豆根瘤菌和bacterium tumefaciens。2、学习微生物纯种分离，培养，和菌落的观察。3、掌握配制培养基，稀释细菌的方法，掌握划线法分离目的细菌。4、培养积极探索的精神和严谨求实的科学态度。 实验目的： 1、大豆根瘤菌的聚落为圆形，稍带隆起，白色，潮湿而有光泽，边缘平滑，内有透明的露珠状细点，外面被有粘膜。2、分离出的菌种用结晶紫染色法染色，在显微镜下放大到1500倍观察，若见两端圆滑，分节，深染，具有鞭毛的杆状体，即判定为根瘤菌。3、根瘤菌在YMA培养基上生长3~5天后可肉眼看见菌落。这是实验的时间规划根据。 实验原理： 4、YMA和LB培养基ph值：7.25、培养温度：25~28oC，避光 6、稀释浓度：5-2~5-5 （5-4最优分离） 7、刚果红染色，区分大豆根瘤菌与bacterium tumefaciens 8、用平行划线法和涂布法分离混杂的菌落 Ph值对大豆根瘤菌生长的影响 第一天 1、制作YMA培养基 2、配制根瘤悬液并稀释 3、接种到培养基上 4、将培养基放入恒温箱培养 一、培养基的配制 1、加入原料 甘露蜜醇：10g 碳酸钙：1.0g 磷酸钾：0.5g 酵母粉0.4g 氯化钠：0.2g 硫酸镁（7结晶水）：0.2g 琼脂：15g 硫酸钙（2结晶水）：0.1g 刚果红：0.25g 2、调节pH至7.2并定容至1000ml 3、分装 将1000mL培养液分成4份于四个 500mL的 锥形瓶中，于121oC温度下高温灭菌。在无菌环境下倒入28个培养基中（24个为两份根廇悬液，4个一组浓度梯度，划线两组涂板一组，1个为空白对照，3个为培养大肠杆菌作为阴性对照），冷却后等待涂板。 二、制备根瘤悬液 个大、饱满、无明显疤痕根瘤 剪刀将其剪下（带 部分根） 清水中浸泡4～5 min 95%乙醇 浸泡 5min两次 用无菌水冲洗5 次 选取适量根瘤 （无菌操作下） 放入研钵中 加入1ml 无菌水 制成悬浮液 将悬浮液按梯度稀释5、52 、53 、54 、55 倍 夹破压碎 搅匀 稀释细菌样品的操作 二、接种培养 第一组： 1号：划线 2号：划线 3号：涂布 52~55 不同浓度分为： 第二组： 1号：划线 2号：划线 3号：涂布 52~55 不同浓度分为： 第三组： 52 红液1号 红液2号 原液1号 原液2号 12个培养皿 12个培养皿 红固1号 红固2号 2个培养皿 4个锥形瓶 阴性组：大肠杆菌 空白组：无菌水 蘸取 一定浓度的菌液 在平板培养基上划线分离 倒置于在28 ℃的温箱中培养3～4 d 将接种针放在酒精灯的火焰上灭菌 略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基盖子内壁处冷却 平板培养基划线法 平板培养基涂布法 用移液枪取 一定浓度的菌液 1ml 在平板培养基上用涂布棒涂布 倒置于在28 ℃的温箱中培养3～4 d 将涂布棒放在酒精灯的火焰上灭菌 略微打开培养皿盖，将涂布棒放在培养基盖子内壁处冷却 平板划线接种法 培养后菌落分布情况 第二天 观察培养基 的情况 练习结晶紫染色法 练习显微镜的使用 （1） 涂片 取洁净的载片一张，用接种环在火焰旁从培养基