[农林牧渔]常规分子生物学操作要点125.pptVIP

* 对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。 能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。  如果我想让这个基因表达得更好呢，怎么办啊？我们可以加上一些增强子，翻译增强序列，内质网定位，以及一些信号肽， 所有这些我们在做实验之前都应该想清楚，我要让我的基因以一种什么样的方式表达，我的表达目的是干什么，我要达到这个表达目的我需要哪些元件，这些元件之间应该是一个怎么样的排列顺序，要达到这个目的，需要有很好的分子遗传学的基础，就是我要知道呢，哪个元件会影响或控制我这个基因的表达，只有这些东西都清楚了，你的实验设计才能清楚。 * 转录增强子和翻译增强序列 * * * 接下来看一下GsCBRLK基因的保守结构域预测结果，它包含激酶催化结构域的11个亚基，同时含有一个钙调素的结合位点。 * 这个结合位点在氨基酸序列上保守性比较差。但是它在二级结构上会形成一个两性的a螺旋。疏水残基和亲水残基分部在螺旋的两边。根据生物信息学的预测结果，147－169这段多肽是潜在的CaMBD * 基于同源序列的克隆技术 已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨基酸水平上表现出一定程度的相似性，在一些区段高度保守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是基于同源序列的候选基因法（homology-based candidate gene method）。 其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对基因组DNA进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这些序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆全长基因。 Sequence analysis of gene GsCBRLK —— By Ph.D. Liang Yang Sequence analysis of gene GsCBRLK —— By Ph.D. Liang Yang The hydrophilic residues were illustrated as circles, hydrophobic residues as diamonds, potentially negatively charged as triangles, and potentially positively charged as pentagons. Hydrophobicity is color coded with green (the most hydrophobic residue) and yellow (zero hydrophobicity) with the amount of green decreasing proportionally to the hydrophobicity. Hydrophilic residues are coded red with pure red being the most hydrophilic (uncharged) residue, and the amount of red decreases proportionally to the hydrophilicity. The potentially charged residues are coded light blue Fig. 2 A helical wheel projection prediction of CaMBD in protein GsCBRLK 目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。 在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，Urao等利用这一方法，根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的E-F手性结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码CDPK的2个cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK 2)，并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。 基因克隆的一种方法－RACE RACE的基本概念 不同