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第十五章基因重组与基因工程 第一节 自然界的基因转移和重组 基因重组(genetic recombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的 一、结合作用 结合作用——质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌） 二、转化及转导作用 （一）转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程 (二) 转导作用 transduction 病毒、噬菌体介导 溶菌途径 溶原菌途径 (三) 转座 反向重复序列 由可移动的DNA序列（插入序列和转座子）介导的基因移位或重排 （一）、插入序列转座 保守性转座 复制性转座 反向重复序列 转座酶 （二）、转座子转座 转座子—可以从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列 四、基因重组 不同DNA 分子间发生的共价连接称重组 （一）位点特异的重组 特异位点 （二）同源重组 同源序列间的重组 第二节 重组DNA技术 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程 胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体 一、重组DNA技术相关概念 （一）DNA克隆 克隆（clone） 无性繁殖 分子克隆(DNA克隆)—应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。 基因克隆、DNA重组、 基因工程 ( genetic engineering) 基因克隆示意图 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 细菌限制修饰体系 限制性核酸内切酶 甲基化酶 识别特异的位点—酶切位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 配伍末端 （三）目的基因 target DNA 目的基因（外源基因） cDNA 逆转录 基因组DNA 基因工程的目的 目的基因拷贝 克隆载体 基因表达产物 表达载体 （四）基因载体 vector 自我复制 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC…） 噬菌体（λ，M13） 真核载体：动物病毒载体pLXSN 质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 1.拷贝数多; 2.两三个抗药性基因 terr ampr 筛选标志 3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一） 二、重组DNA基本技术原理 （一）目的基因获得 化学合成法 基因组DNA 基因组DNA文库—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合 cDNA cDNA文库 4. 聚合酶链式反应 PCR (二)克隆载体的选择和构建 (三)外源基因与载体的连接（DNA连接酶） 连接方式 1. 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 配伍末端 2.平端连接 连接效率低 3.同聚物接尾法 4.人工接头法 (四) 重组DNA导入受体菌 基因工程菌 HB101,JM109 转化 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理 细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态 (五)重组体的筛选 screening/selection 1. 直接选择法 抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 α—互补 蓝白斑筛选 分子杂交 探针 原位杂交 /Sou