实验二 福林.docVIP

姓名：郭沈杰 年级专业：2012级生物科学 同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验二 福林(Folin )-酚试剂法测定蛋白质的浓度 实验目的 熟悉并掌握福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 实验仪器 1.卵清蛋白片 2.7220分光光度计 3.试管 4.移液管 实验试剂 1．Folin-酚试剂A：碱性铜溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。 2．Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。 3．500ug/mL卵清蛋白液：称取0.5g卵清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至 1000ml 实验步骤 标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。 样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。 管号 1 2 3 4 5 6 7 样品 牛血清蛋白液(1mg/ml)ml 蒸馏水ml Folin-酚试剂A 0 0.5 4.0 0.05 0.45 4.0 0.1 0.4 4.0 0.2 0.3 4.0 0.3 0.2 4.0 0.4 0.1 4.0 0.5 0 4.0 0.5（样液） 0 4.0 摇匀，在室温下放置10分钟 Folin-酚试剂B 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 摇匀，在室温下放置30分钟后在500nm下比色 OD500 ? ? ? ? ? ? ? ? 分光光度计的使用方法： 1、连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。 2、接通电源，使仪器预热20分钟。 用MODE键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A），已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F）方式。 3、用波长选择旋钮设置所需的分析波长（500nm）。 将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第二个槽位中。 4、将0％T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0％T”键，此时显示器显示“000.0” 5、按 MODE键选择A模式 将参比样品拉入光路中，按“0A/100％T”键调0A/100％T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。 6、当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，从显示器上得到被测样品的吸光度。 注意事项: 1、比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗→蒸馏水漂洗2次→待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。 2、拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。 3、若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。 4、比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。 5、比色皿的光面要与光源在一条线上。 2.样品测定 准确吸取样液1.0ml于干燥的试管中，加入4ml Folin-酚试剂A，10min后，再加试剂B0.5ml，30min后比色（500nm），对照标准曲线求出样液蛋白质浓度。 实验结果 加入试剂摇匀静置后，溶液呈现不同程度的蓝色，如下图： （从右起，依次为管号1、2、3、4、5、6、7、8的实验结果，最左端8号为样液。） 实验数据记录如下： 原始记录表 实验数据 管号 1 2 3 4 5 6 7 样品 牛清蛋白液ml 蒸馏水ml Folin-酚试剂A 0 0.5 4.0 0.05 0.45 4.0 0.1 0.4 4.0 0.2 0.3 4.0 0.3 0.2 4.0 0.4 0.1 4.0 0.5 0 4.0 0.5（样液） 0 4.0 摇匀，在室温下放置10分钟 Folin