第六讲病毒的检测PPT.ppt

病毒的检测 ;内容提要;病毒的分离与鉴定;标本采集;病料的采集与准备;;病毒的分离与培养;细胞培养相关知识;;动物细胞培养一般流程;原代细胞（primary cell）对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。 二倍体细胞株（diploid cell strain） 将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。 传代细胞系（established cell line） 来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。 HeLa（人子宫癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）等，并有专门机构负责鉴定和保管，如ATCC等 ;细胞培养所需要的一般器材;一般营养要求及培养条件;血清的作用：;细胞培养的方法;;细胞培养应用范畴;应用举例;培养方法 常用的有静置培养和旋转培养，旋转培养产率更高 大部分的病毒以静置培养为主 如轮状病毒，初次分离时旋转培养成功率较静置培养为高。;SARS-CoV in various cell lines;A:正常A72细胞(A72); B:CCV感染后，导致的合胞体细胞 (a)及凋亡现象(b);图3426-1 鸡胚接种途径示意图（据Flint等）;;实验动物;病毒的理化特性测定;脂溶性试验;空斑试验;;Virus Plaques;病毒的空斑（据Madigan等）;终点稀释法;病毒颗粒的检测;电子显微镜技术;电子显微镜观察法 可放大数十万倍，能观察1nm的微粒。;;血凝试验（Hemagglutination assay）;一般将病毒液在血凝反应板上作倍比稀释，加入红细胞 未凝集的红细胞呈圆点或纽扣状沉于孔底 凝集的红细胞弥漫性格状复盖整个孔 ;;血清学检测 ;病毒中和试验（Virus neutralization）;补体结合试验（Complement fixation）;酶联免疫吸附试验（ELISA）;;病毒核酸的检测 ;聚合酶链式反应;M;RT-PCR;核酸杂交;DNA样本经限制性内切酶消化，凝胶电泳，变性，转移到滤膜上，然后用放射性同位素标记的病毒核酸序列探针检测结合到固相滤膜上的DNA。目前放射性同位素标记的核酸探针很少使用，而大多用非放射性标记探针（如生物素标记）进行检测。一种改良的方法，称为斑点杂交，可用于样本中病毒核酸的快速检测。 Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解。 Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的。;Sorthern Blot;DNA芯片（DNA microarray chip）;;