第04章-免疫组化技术-2PPT.pptVIP

第四节 亲和免疫组织化学技术; 一、生物素-抗生物素免疫组织化学技术 （一）基本原理 鸡蛋中含有一种碱性蛋白，属于糖蛋白，也称卵白素（avidin），分子量68000。卵白素具有4个与维生素H或称生物素（biotin）亲和力极高的结合位点。生物素是一种小分子维生素，分子量244，它与卵白素之间的亲和力比抗原抗体之间的亲和力高100万倍，因而能彼此牢固缔结和而不影响各自的生物活性。同时，生物素与卵白素都具有与其他标记物如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等结合的能力。目前，已利用上述特性建立了卵白素-生物素免疫染色系统，为了便于理解，现在统称卵白素为抗生物素或亲和素，因此，卵白素-生物素免疫染色系统又称为生物素-抗生物素免疫组织化学技术; （1）石蜡切片脱蜡至水，用0.01mol/L PBS（pH=7.4）漂洗5min×3次； （2）滴加0.3% H2O2，37℃孵育10min，阻???内源性过氧化物酶； （3）用0.01 mol/L PBS漂洗5min×3次； （4）滴加10%正常血清/0.3%Triton X-100/0.01 mol/L PBS，37℃孵育10 min； （5）滴加抗小鼠单克隆抗体（一抗）37℃ 1 h或4℃过夜，PBS漂洗5min×3次； （6）加生物素标记二抗（效价1:200），室温孵育10 min，PBS漂洗5min×3次； （7）滴加链霉素抗生物素蛋白-HRP液，室温孵育10min；PBS洗5min×3次； （8）滴加DAB，显微镜下显色5~10min ; （二）ABC免疫组织化学技术 1981年，许世明等建立了抗生物素-生物素-过氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidase complex method，简称ABC法）。ABC是卵白素-生物素结合的HRP复合物的简称。ABC复合物是先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应，使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素，留出一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显 ; （三）SABC免疫组织化学技术 链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，分子量60000， 含糖链。链霉亲和素也有四个生物素亲合位点，是一种更理想的抗生物素结合蛋白。SABC是链霉亲和素-生物素-HRP复合物（strept-avidin-biotin-peroxidase complex）的简称。SABC复合物先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与链霉亲和素反应，使每一个链霉亲和素分子上结合3个带HRP的生物素，留出一个尚未被生物素结合的空位，可以与各种生物素标记的抗体结合。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显 ; SABC法是在一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgG抗体二抗桥接。然后用SABC孵育，使桥抗上的生物素与SABC中链霉亲和素上的空位结合。最后仍用HRP的底物成色。在SABC法中，一抗是特异性的，二抗是生物素标记的二抗，三抗是SABC复合物。SABC复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此SABC复合物没有种属特异性，可适用于任何种属的一抗。 当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因此，SABC法较PAP法操作更简单、更灵敏。目前，SABC试剂盒已经商品化，可以根据需要购买。; （四）PAP法与ABC法联合（ABPAP）技术; ABPAP使特异性一抗结合更多的酶分子，原始信号得 到更大的放大效应。 （1）石蜡切片脱蜡至水 （2）滴加0.3% H2O2，80%甲醇抑制内源性过氧化物酶 （3）用0.1 胰蛋白酶室温消化10min （4）滴加二抗的正常血清1:10；； （5）滴加适当稀释的一抗； （6）加适当稀释的标记二抗； ;（7）滴加鼠PAP或兔PAP； （8）生物素化马抗鼠或羊抗兔； （9）滴加ABC复合物； （10）滴加0.04% DAB + 0.03% H2O2， （11）蒸馏水漂洗，苏木精复染（必要时），脱水、透明、封片、观察。 评价 ABPAP法较单一PAP法和ABC法更为敏感，抗体稀释度大大提高，尤其是对抗原性较弱、容易破坏或丢失的抗原，能得到较好的效果。但ABPAP法较单一PAP法和ABC法步骤增多、操作复杂，背景着色会相应加深，而且容易脱片。 ; 二、葡萄球菌蛋白